实时定量PCR检测胰岛素和高糖对巨噬细胞ACAT-1表达的影响

目的利用实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)mRNA的表达。探讨胰岛素和高糖对人THP-1细胞分化的巨噬细胞ACAT-1mRNA表达的影响。方法体外培养人单核细胞株THP-1细胞,由佛波醇肉豆蔻酸乙酸盐(PMA)作用使其分化为巨噬细胞,后者再由胰岛素和高糖共同干预不同时间(0、6、12、24、48h),用实时定量PCR检测ACAT-1mRNA表达。结果胰岛素和高糖共同作用不同时间后巨噬细胞ACAT-1mRNA的表达量间差别有显著性意义(P<0.01),作用12h与0、6、24、48h的ACAT-1mRNA表达量间差别均有显著性意义(P<0.01),作用48h的ACAT-1mRNA表达量与0h相比差别无显著性意义(P>0.05)。结论胰岛素和高糖共同作用下,巨噬细胞ACAT-1mRNA表达逐渐增加,12h达到高峰,然后逐渐下降,48h恢复到0h时水平。成功建立和应用实时定量PCR检测巨噬细胞ACAT-1mRNA水平是准确评价巨噬细胞功能的方法之一。     

人肌细胞增强因子2A基因病毒载体构建及嗜铬细胞瘤PC12稳转细胞系的建立和鉴定

目的构建表达肌细胞增强因子2(MEF2)A基因的反转录病毒载体,并观察稳定感染嗜铬细胞瘤PC12细胞后MEF2A蛋白的表达情况。方法用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA3-MEF2A-flag质粒,得到MEF2-flag基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化后获取反转录病毒颗粒。将反转录病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出。采用Western印迹法检测MEF2-flag的表达情况。结果连接重组后经酶切和测序筛选出pBabe-MEF2A-flag。转染pBabe-MEF2A-flag的PC12的细胞组中MEF2A的含量为2.03±0.06,显著高于空载体对照组的1.00±0.04(P<0.01)。结论成功构建pBabe-MEF2A-flag反转录病毒载体,并建立了其稳定转染的PC12细胞系。     

人SUMO病毒载体构建及稳转神经母细胞瘤SHSY5Y细胞系的建立

目的构建表达人小泛素化相关修饰蛋白(SUMO)基因的逆转录病毒载体,并观察其稳定感染神经母细胞瘤SHSY5Y细胞后SUMO蛋白的表达情况。方法用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA 3.0-HA-SUMO1、pcDNA3.0-HA-SUMO2、pcDNA 3.0-HA-SUMO3质粒,得到3×Flag-SUMOs基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化获取逆转录病毒颗粒。将逆转录病毒颗粒感染SHSY5Y细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出。Western blot检测稳定转染的pBabe-3×Flag-SUMOs-SHSY5Y单克隆细胞SUMO1～3的表达。结果 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro质粒构建正确。稳定转染的SHSY5Y细胞系3×Flag-SUMOs表达明显增强。结论成功构建了稳定表达SUMO的pBabe-3×Flag-SUMOs-SHSY5Y细胞系。     

不同剂量脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的凋亡机制

目的研究不同剂量脂多糖(LPS)诱导的不同程度急性肺损伤(ALI)的细胞凋亡机制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠20只,随机分为4组,每组5只,分别在七氟烷麻醉下经尾静脉注射1 mL 0.9%氯化钠溶液(对照组)或LPS 5、10、20 mg/kg(分别为LPS5组、LPS10组和LPS20组)。6 h后处死大鼠,通过苏木精-伊红染色观察大鼠肺组织形态学改变,肺组织湿/干比值(W/D值)评估肺组织水肿,脱氧核苷酸末端转移酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)染色法检测肺组织细胞凋亡,Western印迹法检测肺组织中天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和凋亡诱导因子(AIF)的表达水平。结果光学显微镜下可见对照组大鼠肺组织无明显损伤,LPS5组大鼠肺组织结构轻微破坏,LPS10组和LPS20组大鼠肺组织损伤严重。LPS5组、LPS10组、LPS20组的W/D值均显著高于对照组(P值均<0.05),且随着LPS剂量的增加,LPS5组、LPS10组、LPS20组的W/D值依次增大,两两比较的差异均有统计学意义(P值均<0.05)。对照组大鼠肺组织基本未见到凋亡细胞,LPS5组、LPS10组、LPS20组大鼠肺组织的细胞凋亡率均显著高于对照组(P值均<0.05),凋亡细胞以肺泡上皮细胞为主。LPS5组大鼠肺组织中活化Caspase-3的相对表达量显著高于对照组(P<0.05),而LPS10组和LPS20组与对照组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。LPS5组大鼠肺组织中活化AIF的相对表达量较对照组有增加的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),但LPS10组和LPS20组活化AIF的相对表达量均显著高于对照组(P值均<0.05)。结论不同剂量LPS诱导的ALI中,5 mg/kgLPS诱导的较轻的ALI主要激活了Caspase-3凋亡途径,而10和20 mg/kg LPS诱导的较严重的ALI则主要活化AIF凋亡信号,这为ALI的抗凋亡治疗提供了潜在的靶点。     

新型冠状病毒感染危重症患者救治的麻醉科推荐方案

新型冠状病毒感染(曾称为新型冠状病毒肺炎), 是一种传播迅速、对人类生存危害极大的传染病, 其在老年群体中的危重患者比例要远高于其他年龄段群体。近期国家管控政策将其调整为"乙类乙管"后[1], 感染人数迅速增加。新型冠状病毒感染后约有8%的患者出现肺炎表现[2], 重症和危重患者所占感染人数的百分比虽然很低(据报道2022年2～6月份上海地区奥密克戎BA.2感染者发生重症、危重症风险仅为0.27%)[3], 但是由于当下总体感染总数已达中国总人口数量的一半以上, 所以重症、危重症患者的绝对数不容低估。鉴于在已知危重患者中, 死亡患者多为老年人, 多伴随各类基础性疾病, 且病毒主要损伤肺及肾、心、脑等重要脏器;而终末期直接致死的主要表现为肺功能严重损害(俗称"白肺"), 所以救治的重点理应从处理肺部损伤入手。     

葡萄糖对THP-1源性巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达的影响

研究葡萄糖对人THP-1单核分化巨噬细胞酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT-1）表达的影响。发现高糖作用下，巨噬细胞ACAT-1的mRNA及蛋白表达增加，这可能是糖尿病血管病变机制之一。     

全麻机制研究——细胞内钙离子信号通路研究进展

全身麻醉药物的分子作用机制及细胞作用机制虽不明确,但是其对神经递质释放的影响已经达到共识:一方面全身麻醉药物分子与离子通道蛋白或突触蛋白直接作用可以改变神经递质的释放,另一方面也可能通过改变细胞内信号通路而影响神经递质的释放。作为细胞内的重要信使,钙离子浓度([Ca2+]i)受到钙内流系统、钙外流系统及内质网等多方面调节,而存在于这些调节通路的蛋白受体大多数被证明是全身麻醉药物的潜在作用位点。细胞内钙离子最终影响细胞兴奋性和神经递质的释放的重要作用,使得全身麻醉药物调节[Ca2+]i成为研究全麻机制的重要方面。     

人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1基因P7启动子调控的报告基因载体的构建及鉴定

应用PCR方法从人单核细胞系THP-1基因组DNA扩增人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase1, ACAT1)基因 P7启动子全长片段,进行TA克隆,经双酶切、测序鉴定阳性克隆.将该基因亚克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer,用DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)法将重组质粒pGL3E-P7瞬时转染入单核细胞THP-1,检测其活性,证明pGL3E-P7能在体外表达荧光素酶.人ACAT1基因P7启动子调控的荧光素酶报告基因表达载体的成功构建,为研究动脉粥样硬化过程中ACAT1基因的转录调控机制提供新手段.     

泛素相关小修饰蛋白-1在大鼠脑发育过程中的差异性表达

目的探讨泛素相关小修饰蛋白(SUMO)-1在Sprague-Dawley(SD)大鼠脑发育过程中的不同表达及其意义。方法采用实时定量聚合酶链反应、Western印迹法分析及免疫组织化学法检测SUMO-1蛋白在大鼠脑发育不同时期的表达。结果胚胎期15 d(E15)、胚胎期18 d(E18)、新生期(P0)、1周龄(P7)、2周龄(P14)、6月龄(P180)大鼠的SUMO-1 mRNA水平分别为26.106 8±0.427 5、25.234 0±1.076 2、23.340 1±0.327 6、22.683 3±0.695 3、20.546 9±1.757 2、16.708 5±2.927 4。与E15大鼠比较,P7、P14、P180大鼠脑组织中SUMO-1 mRNA水平均显著降低(P值均<0.05),P180大鼠的SUMO-1 mRNA水平又显著低于P7、P14大鼠(P值分别<0.05、0.01),P7大鼠与P14大鼠间SUMO-1 mRNA水平的差异无统计学意义(P>0.05)。E15、E18、P0大鼠脑组织中结合状态SUMO-1蛋白的表达量较高,出生后随着生长发育,P7及P14大鼠结合状态SUMO-1蛋白的表达量较E15大鼠降低,P180大鼠结合状态SUMO-1蛋白的表达量较E15大鼠显著降低。E18大鼠小脑组织外颗粒层(EGL)、浦肯野细胞层(PCL)中均有SUMO-1表达;P14大鼠EGL、PCL、内颗粒层(LGL)中均有SUMO-1表达;与E18大鼠比较,P14大鼠PCL中SUMO-1蛋白的含量显著减少(P<0.05)。SUMO-1蛋白在发育早期的海马原基中已有表达,与E18大鼠比较,P14大鼠海马中SUMO-1蛋白的含量显著增多(P<0.05)。E18大鼠含有丰富神经干细胞的室管膜区(VZ)+室管膜下区(SVZ)内的SUMO-1蛋白含量很高,在皮质板区(CP)内也有表达;与E18大鼠比较,P14大鼠VZ+SVZ的SUMO-1蛋白含量显著减少(P<0.05);E18大鼠VZ+SVZ的SUMO-1蛋白含量显著高于同时期脑组织的其他部位(P值均<0.01)。结论在SD大鼠脑发育的不同时期,SUMO-1在空间及数量上的表达均有差异。