人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定

目的　获得人源中和性抗戊型肝炎病毒 (HEV)单克隆基因工程抗体。方法　采用五轮筛选法 (逐轮降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原淘筛本室构建的HEV患者外周血源的噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的噬菌体抗体 ,酶切鉴定抗体基因插入。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因构建表达载体 ,在大肠杆菌中可溶性表达抗HEV抗体Fab段 ,ELISA、Westernblot检测抗体免疫学活性 ;测序分析抗体基因。结果　筛选出 4株与含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。切去gⅢ基因 ,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段 ,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中差异无显著性。可溶性抗体与含中和抗原表位的HEVORF2重组混合抗原有特异结合活性 ,与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Westernblot显示在相对分子质量 (Mr)略大于 4 5× 10 3 处有一明显条带 ,与Mr4 8× 10 3 的Fab大小一致。DNA测序分析表明 ,Fab段VH 属于IgGVH3基因家族 ,VL 属于Vκ1基因家族。结论　利用噬菌体抗体库技术成功获得抗HEV的人源单克隆抗体。     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗小鼠乳腺癌的研究

目的:探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782/5S-8102形成肿瘤的体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法:体内实验分动物致瘤组、抑瘤实验组和治疗实验组。分别按实验组别要求接种5.0×106细胞/只于BALB/C小鼠的右腋窝皮下,观察各组肿瘤形成及肿瘤治疗情况并统计各组生存期。治疗结束后将标本制成石蜡切片进行病理学分析,RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达情况。统计学处理采用SPSS软件进行完全随机的方差分析(ANOVA)。结果:实验结果显示小鼠成瘤率为100％。丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)可明显抑制MA782/5S-8102/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。经GCV治疗后,MA782/5S-8102/TK组和混合细胞组的肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约36.7％和28.6％(均P<0.001);生存期也明显延长(P<0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论:逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内对乳腺癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应。     

用套式PCR检测新生儿先天性巨细胞病毒感染

选取HCMV AD169棘EcoRI J片段区的IEA基因第四外显子为扩增靶序列，合成两对引物，外引物扩增242bp片段，内引物扩增146bp的片段，此方法很灵敏，可检测5-10fg HCMV DNA．我们随机采集51名新生儿脐带血，应用NaI法提取垒血DNA为模板进行扩增，结果表明；32名为HCMV DNA阳性，以口腔粘液DNA(40名)为模扳进行扩增，24名为HCMV DNA阳性。因此，套式PCR可用于临床上快速准确地检测HCMV。     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

PCR检测婴儿肝炎综合征中巨细胞病毒感染

采用PCR技术对37例肝炎综合征患者进行了检测。结果表明,24例为HCMV阳性,占被检人数的64.9%,与已报导的资料相比,PCR方法的阳性检出率明显高于目前使用的其它方法.此外,灵敏性和特异性试验表明,HCMV—PCR方法足以能检测出0.1pg的HCMV的DNA,无非特异性带出现,因此,PCR技术具有高度敏感、特异性强、简单快速等优点,可以用于临床检测和诊断。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

原发性肝癌患者血清ROS、NO、SOD水平分析

目的 对原发性肝癌患者血清ROS、T-SOD、MnSOD、NO测定,分析它们之间的相互关系及与正常人的关系。方法 采用经病理切片确诊的30例原发性肝癌患者血清,对照组30例,NO采用硝酸还原酶法,T—SOD及Mn-SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定,活性氧(ROS)采用Fenton反应及Gtordd显色原理测定。结果 原发性肝癌患者ROS和NO水平明显高于正常组(P＜0．01),T—SOD和Mn-SOD水平明显低于正常组(P＜0．01);ROS水平与Mn-SOD水平负相关(r=-0．9745,P＜0．01),T—SOD水平与NO水平负相关(r=-0．9112,P＜0．01),ROS与NO水平正相关(t＝9．9,r＝0．9376,P＜0．01),而其他结果之间无相关性。结论 原发性肝癌ROS的水平与Mn-SOD水平负相关,提示线粒体内Mn-SOD清除自由基能力下降从而引起ROS升高,可能与原发性肝癌的发生有关;NO升高并与T—SOD负相关、与ROS正相关提示NO可能作为一种介质和自由基参与肿瘤发生,与ROS具有协同作用。     

口腔鳞癌细胞系HLAI类分子异常表达及其机制探讨

为探讨两个口腔鳞癌细胞系 (KB和Tca81 1 3)中HLAI类抗原的表达水平及其异常的分子机制。利用流式细胞术、Westernblot检测细胞系中HLAI类抗原在蛋白水平的表达 ;RT PCR检测细胞系在转录水平的表达。结果两个口腔鳞癌细胞系中HLAI类抗原蛋白水平的表达下调 ;RT PCR结果显示Tca81 1 3细胞系中A、B、C、LMP2、LMP7、LMP1 0基因的mRNA表达下调 ;在KB细胞系中除了A、B、C、LMP7、LMP1 0基因的mRNA表达下调 ,LMP2、PA2 8α基因的mRNA表达显著减少或缺失 ;而TAP1、TAP2、Tapasin基因在mRNA水平的表达无改变。IFN γ诱导后纠正了多个基因在mRNA水平的异常表达。两个口腔鳞癌细胞系中HLAI类抗原表达下调 ,且多基因在转录水平的异常也即转录效率的低下很可能是该下调的重要原因     

用套式PCR检测新生儿先天性巨细胞病毒感染

选取ＨＣＭＶＡＤ１６９株ＥｃｏＲＩＪ片段区的ＩＥＡ基因第四外显子为扩增靶序列，合成两对引物，外引物扩增２４２ｂｐ片段，内引物扩增１４６ｂｐ的片段，此方法很灵敏，可检测５－１０ｆｇＨＣＭｖＤＮＡ。我们随机采集５１名新生儿脐带血，应用ＮａＩ法提取全血ＤＮＡ为模板进行扩增，结果表明：３２名为ＨＣＭＶＤＮＡ阳性，以口腔粘液ＤＮＡ（４０名）为模板进行扩增，２４名为ＨＣＭＶＤＮＡ阳性。因此，套式ＰＣＲ可用于临床上快速准确地检测ＨＣＭＶ。     

胸苷激酶基因对乳腺癌细胞的杀伤性研究

目的　探讨逆转录病毒 (RV )载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV -TK )基因转染小鼠乳腺癌细胞 ,联合抗病毒药物丙氧鸟苷 (GCV )对小鼠乳腺癌细胞系MA 782 /5S -810 2体外杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法　采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA3 17、G 418筛选抗性克隆 ,采用PCR方法检测HSV -TK基因整合情况。取滴度最高的病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA 782 /5S -810 2 ,经G 418筛选后 ,得到带有HSV -TK基因的MA 782 /5S -810 2 /TK细胞 ;将MA 782 /5S -810 2和MA 782 /5S -810 2 /TK细胞按不同比例混合培养后 ,给予 10 μg/mlGCV ,4天后采用MTT法计算细胞成活率 (SR ) ,观察旁观者效应。结果　GINaTK载体成功转入包装细胞PA 3 17,病毒滴度为 4.0× 10 4cfu/ml。用病毒上清液感染MA 782 /5S -810 2 ,成功得到了表达HSV -TK基因的MA 782 /5S -810 2 /TK细胞。混合培养结果显示 ,当MA782 /5S -810 2 /TK细胞数占混合细胞数 10 %时 ,低浓度 (10 μg/ml)的GCV就可将 5 0 %左右的肿瘤细胞杀死。 结论　逆转录病毒可介导HSV -TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782 /5S -810 2并获稳定表达 ,RV -HSV -TK /GCV系统杀伤癌细胞存在旁观者效应。