脱细胞骨软骨支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外复合的实验研究

目的 测定经自创的去垢剂--酶法进行脱细胞和脱钙处理的脱细胞骨软骨支架的细胞相容性,及该支架与软骨细胞体外复合培养的生物学特性和粘附关系, 以探讨脱细胞骨软骨支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法 采用自制脱细胞骨软骨支架与软骨细胞体外复合培养，用细胞增殖度法测定脱细胞骨软骨支架的细胞相容性，并行电镜观察其相互粘附关系。结果 脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好；体外复合实验中，软骨细胞可贴附于材料上生长增殖，并分泌细胞外基质。结论 细胞增殖实验显示脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好；体外复合实验显示脱细胞骨软骨支架可与软骨细胞良好复合，适于软骨细胞贴附生长。     

聚己内酯与左旋聚乳酸共聚物支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外复合的实验研究

目的:测定聚己内酯与左旋聚乳酸共聚物(poly-caprolactone-b-poly L-lactide,简称PCL-b-PLLA)支架的细胞相容性,探讨PCL-b-PLLA作为软骨组织工程支架的可行性. 方法:用MTT比色法测定PCL-b-PLLA支架不同浓度浸提液与L929小鼠成纤维细胞的相容性,观察测定吸光度(A值), 对支架与软骨细胞复合体行电镜观察. 结果:实验组与对照组的A值相比差异无显著性意义(P>0.05), PCL-b-PLLA支架对细胞增殖无明显促进或抑制作用, 不同浓度支架浸提液的细胞毒性评级均为0级, 电镜显示软骨细胞完全平铺于支架的表面,细胞表面有大量微小突起和基质分泌. 结论:体外复合实验显示PCL-b-PLLA支架具有良好的生物相容性,适于软骨细胞贴附生长, 可作为软骨组织工程支架.     

间充质源性软骨种子细胞与脱细胞软骨复合培养构建软骨组织

目的兔外周血间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养,构建新型软骨组织,为临床修复器官缺损及再造提供实验基础。方法提取兔外周血间充质干细胞,行体外诱导培养14 d获得软骨种子细胞,显微镜下观察细胞生长特性,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。联合去垢剂—酶法获得兔脱细胞肋软骨支架,软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨支架体外复合培养7 d获得复合软骨,脱细胞软骨及复合软骨固定后行扫描电镜观察及组织学HE、甲苯胺蓝染色。结果兔外周血间充质干细胞体外诱导培养14 d,胞浆内较多软骨细胞特异性Ⅱ型胶原分泌;兔脱细胞软骨呈乳白色,结构完整、孔隙均匀,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分,其孔隙率(61.31±8.45)%,孔径长度(32.80±5.15)μm。支架与软骨细胞黏附良好,并伴有多量基质分泌。结论间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养可构建新型软骨组织,本研究为临床修复器官缺损及再造提供了实验依据。     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

β-磷酸三钙-脱细胞软骨支架复合兔BMSCs修复膝关节软骨缺损的实验研究

目的观察纳米磷酸三钙人工骨(β-TCP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、脱细胞耳软骨(DC)复合软骨细胞修复关节软骨缺损的效果。方法获取新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),培养并体外诱导成软骨细胞,取异体兔耳软骨进行脱细胞处理,与β-TCP形成复合支架作为载体接种软骨细胞,加入TGF-β和IGF-I修复膝关节软骨缺损。实验动物(n=18)分为3组,实验组(n=8)复合支架加入TGF-β和IGF-I,对照组(n=6)仅以复合支架修复缺损,空白组(n=4)不加入任何修复材料。结果 BMSCs在体外生长稳定,增殖能力强,可被诱导为软骨细胞。软骨支架脱细胞完整,软骨陷窝排列有序,复合物植入缺损后第20周,实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,与周围正常软骨连接良好。结论β-TCP-DC复合支架有较多的孔隙结构,降解速度快,组织相容性及细胞黏附性好,是组织工程修复关节软骨理想的种子细胞载体。     

利用脱细胞骨软骨纤维支架形成可修复软骨缺损的软骨-骨复合组织

【立论依据】 目前,因自体软骨组织修复力极其有限,故对软骨缺损的治疗是临床上的一大难题。现在的治疗方式多为手术移植治疗,包括自体骨移植,单一软骨组织移植以及高分子材料支架移植,但存在损伤大,细胞存活率低和机体相容性差等不足。对此,体外构建一种克服传统治疗缺点的新的组织工程材料显得极其重要。 【设计思路】 因自体骨移植损伤大,故设计体外构建组织材料;因单一软骨组织移植机体相容性差,故设计构建软骨骨复合组织;因软骨细胞存活率低,故设计构造脱细胞骨软骨纤维支架种植细胞,提供骨、软骨细胞最佳生长微环境。所以,实验设计体外利用异体脱细胞骨软骨纤维支架构建软骨-骨复合组织,再移植到动物体内生长,从而提供一种治疗软骨缺损性疾病的新的组织工程材料。 【实验内容】 (1)分离、纯化与培养兔骨髓中的间充质干细胞。(2)体外脱细胞处理家兔髌骨股骨侧的骨软骨块构建骨软骨纤维支架,对支架进行力学测试、镜下观察、异体免疫性观测等。(3)将间充质干细胞移植到脱细胞支架上,利用支架双层存留细胞外基质的诱导作用在骨和软骨层分别诱导干细胞分化形成成骨细胞和软骨细胞。(4)将得到的复合组织移植到裸鼠背部皮下,跟踪观测组织直径大小变化、生长状况、组织构成等。(5)构建兔膝关节股骨关节面软骨缺损模型,进行移植手术,持续观测实验对象膝关节活动度及应力性、影像学表现,最后做缺损修补处切片镜下观察对比,分析评估实验构建组织工程材料是否优于传统移植材料。 【材料】 实验动物家兔、裸鼠;30 g/L戊巴比妥钠、胎牛血清、0.35 mmol/L苯甲基磺酰氟、1% TritonX-100等。 【可行性】 实验动物和相关试验方法为常规操作,且已有相关实验基础。 【创新性】 实验设计的骨软骨复合组织克服了传统移植所用单一软骨组织机体相容性低和细胞存活率低的缺点,可以实现从试验台到临床的转化医学概念,为软骨缺损性疾病的移植治疗提供思路,有重要的临床意义。     

脱钙骨基质的制备及与软骨细胞体外复合的实验研究

目的：探寻良好的软骨组织工程支架材料。方法：制备兔脱钙骨基质（decalcified bone matrix,DBM）,采用液体置换法检测经脱钙2、3、4 d支架材料的孔隙率。扫描电镜观察DBM的超微结构,以及软骨细胞与DBM体外复合培养3 d的黏附情况。结果：脱钙3 d的DBM多孔结构及空隙适合软骨细胞的黏附和增殖。软骨细胞和DBM体外培养3 d黏附良好。结论：DBM是良好的软骨组织工程支架材料。     

丝素蛋白无纺网支架体外构建组织工程化软骨

目的:探讨丝素蛋白无纺网作为耳廓软骨细胞外支架构建组织工程化软骨的可行性。方法:取成年新西兰兔耳廓软骨,酶消化法获取软骨细胞,体外培养扩增后取原代细胞接种到制备好的丝素蛋白无纺网支架上,体外复合培养。每天倒置显微镜下观察细胞黏附、生长、增殖情况,于复合培养第3、7、10天时取材进行扫描电镜观察;于复合培养第1、2、4、6周取材进行组织学评价,同时取材通过RT-PCR方法检测复合物上软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。结果:48 h后软骨细胞已黏附于丝素蛋白纤维上,72 h后细胞开始分泌少量细胞外基质;电镜下观察显示软骨细胞及分泌的薄层细胞外基质主要分布于支架材料表面。组织学观察显示2周时支架浅层已有一定厚度软骨组织,可见少量类软骨陷窝,4周和6周时支架浅层软骨组织增厚,软骨陷窝增多,但支架内部软骨细胞数目少,细胞呈星形或梭形,细胞分泌的基质也很少。RT-PCR检测显示在各检测时间点均有Ⅱ型胶原mRNA的表达。结论:兔耳廓软骨细胞在丝素蛋白无纺网支架上已初步形成软骨样组织,但培养条件应进一步优化。     

胶原凝胶复合CPPf/PLLA支架与软骨细胞的相容性研究

目的研究软骨细胞与胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架的细胞相容性,为软骨组织工程提供适宜的种子细胞载体。方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入CPPf／PLLA三维支架并进行体外培养,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上粘附、生长和增殖等情况,从组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对复合组织进行评价。结果软骨细胞能良好地在支架上粘附、生长和增殖,新形成的组织为透明软骨样组织、细胞外基质有Ⅱ型胶原分布。结论胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为软骨细胞栽体。     

纳米HA/CS支架穿“靴”复合软骨样细胞修复兔关节软骨和软骨下骨缺损

【目的】观察把骨髓间质干细胞(BMSCs)诱导成的软骨细胞与纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(nano-HA/CSscaffold)通过特殊的穿"靴"结构复合构建而成组织工程软骨复合体的可行性,并观察此复合体修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损的能力。【方法】原位复合和冷冻干燥相结合的方法制备nano-HA/CS支架,用聚四氟乙烯制作成圆柱形"靴"结构。把BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后,接种于穿"靴"的nano-HA/CS支架底部,把细胞-支架复合物置入成软骨条件培养液中培养2周。扫描电镜观察nano-HA/CS支架结构及细胞-支架复合体结构。30只新西兰大白兔的股骨髁制造直径4 mm、深8 mm的骨软骨缺损,随机分为实验组、对照组、空白组,于缺损处分别植入经穿"靴"结构复合的软骨支架复合体、不经穿"靴"结构复合的软骨支架复合体,空白组仅造缺损,4、12周后取材初步观察修复情况。【结果】BMSCs经软骨诱导液诱导后转化成软骨细胞;制备的nano-HA/CS支架支架孔隙率为92%,平均孔径为125μm,与软骨细胞有较好的粘附性。大体观察实验组和对照组缺损均有类软骨样组织生长,空白组缺损明显,见纤维组织生长。苏木精-伊红染色切片观察实验组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复,两者耦合处部分交叉,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于对照组和空白组。3组的大体评分和软骨组织学评分统计分析,实验组优于对照组和空白组。【结论】BMSCs具有成软骨潜能,nano-HA/CS支架具有较好的细胞相容性;软骨细胞与nano-HA/CS支架经过穿"靴"结构可成为组织工程软骨复合体,并初步证实有修复兔软骨及软骨下骨缺损的能力。     

胎兔成骨细胞与复合肝细胞生长因子/异种脱蛋白松质骨的体外培养

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的胎兔成骨细胞在异种脱蛋白松质骨(DPB)支架上黏附行为及增殖和分化功能的影响.方法:成骨细胞从胎兔中分离,实验组为HGF/DPB与成骨细胞复合培养,对照组为DPB与成骨细胞常规培养.通过电镜观察成骨细胞在HGF/DPB表面生长与附着状态,同时检测细胞增殖状况和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性等,评价成骨细胞生长情况和细胞活性.结果:成骨细胞在复合肝细胞生长因子脱蛋白骨外表面及孔隙内表面均可贴附生长,增殖、分化良好.HGF/DPB对成骨细胞的ALP活性有明显的促进作用,并能促进成骨细胞的增殖.结论:HGF/DPB具有良好的生物相容性和骨诱导作用,可作为骨组织工程备选的复合支架材料.     

软骨细胞与复合水凝胶的生物相容性研究

目的构建光固化壳聚糖与自固化海藻酸钠复合水凝胶体系,研究其与软骨细胞的体外生物相容性,探索其作为软骨组织工程支架的可行性。方法以三维多孔光固化壳聚糖水凝胶作为细胞的空间载体,利用自固化海藻酸钠水凝胶将软骨细胞胶封入光固化壳聚糖水凝胶支架,构成复合水凝胶-细胞复合体。采用扫描电子显微镜观察光固化壳聚糖的结构形貌以及细胞在支架内部的分布与形态;CCK8法绘制细胞增殖曲线;DAPI细胞核染色荧光显微镜观察细胞核形态变化,判断细胞活性。结果纯光固化壳聚糖水凝胶材料呈孔隙较为均匀一致的多孔结构,平均孔径为300μm左右。复合水凝胶能够模拟天然软骨细胞外基质环境,使细胞保持圆形生长状态;促进成软骨细胞的增殖,具有良好的生物相容性。结论复合水凝胶能够为软骨细胞提供一个类似天然的生活环境,并能够促进其增殖、生长,有望作为软骨组织工程支架应用于软骨缺损修复的实验研究。     

兔髁突细胞与可吸收明胶海绵复合培养的研究

目的: 研究明胶海绵作为颞下颌关节组织工程支架材料应用的可行性.方法: 采用胶原酶阶段消化法获取兔髁突软骨中的纤维软骨细胞,取经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)扩增的第3代细胞与已用多聚赖氨酸修饰的明胶海绵复合培养,进行噻唑蓝(MTT)比色及光镜、扫描电镜观察.结果: 纤维软骨细胞于明胶海绵孔壁内牢固粘附,5 d开始增殖,4 W时有大量细胞生长于明胶海绵上.结论: 明胶海绵表现出良好的亲水性、细胞吸附性和体外生物相容性,可作为组织工程细胞培养支架材料用.     

COA:细胞外基质来源的双层支架的研制及其修复犬膝关节负重区骨软骨缺损的实验研究

背景与目的 骨软骨损伤常见且修复困难,本研究探讨采用软骨细胞外基质（CECM)与脱细胞骨基质（ACBM)为材料制作新型组织工程骨软骨双层支架的可行性,并检测其联合骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）修复犬膝关节负重区骨软骨联合缺损的疗效。 方法 ⑴新型组织工程骨软骨双层支架的骨部分以犬松质骨制备的ACBM为原料,软骨部分以人CECM为材料：将天然软骨粉碎成微丝并脱细胞处理后配成30 g/L的乳状悬液,将ACBM浸于盛CECM悬液的模具中,采用冷冻冻干法制备CECM/ACBM双层支架并交联。进行组织学、扫描电镜、Micro-CT观察,测定支架孔隙率,采用MTT法分析支架浸提液毒性。⑵ 将成软骨诱导的BMSCs种植到双相支架上体外构建组织工程骨软骨复合体,并以此复合体修复犬膝关节股骨髁负重区骨软骨缺损,分为细胞-双相支架组(实验组)和单纯支架组（对照组）,分别在3和6个月时取材,根据大体、组织学、生物力学、生物化学、Micro-CT等检测结果进行半定量或定量评估。 结果 支架评估：组织学显示双层支架去细胞彻底,无细胞碎片残留;CECM部分番红O及Ⅱ型胶原免疫荧光染色呈阳性。扫描电镜及Micro-CT观察显示支架内孔洞相互贯通呈海绵状,CECM部分孔径(155±34）μm,孔隙率为91.3%±2%;ACBM部分具有天然骨的孔径和空隙率,骨软骨部分结合良好。MTT法显示,不同浓度支架浸提液与对照培养液吸光度值比较,差异无统计学意义（P>0.05）。在修复犬膝关节骨软骨缺损的实验中,结果显示两组以纤维软骨或透明软骨对缺损有不同的修复,大体以及组织学评分表明实验组明显优于对照组,生物力学测试表明6月实验组修复软骨的刚度为正常膝关节软骨的70.1%,与生物化学分析结果一致;软骨下骨的刚度达到正常膝关节的74.96%。Micro-CT结果表明实验组与对照组软骨下骨重建不具备明显差异。结论 CECM /ACBM骨软骨双层支架保留了骨、软骨的细胞外基质成分,具备良好的孔径和孔隙率,骨-软骨两层间结合良好,无毒,生物相容性良好,可作为支架载体用于组织工程骨软骨复合体的构建。骨软骨双相支架复合成软骨诱导的BMSCs能成功修复犬膝关节负重区的骨软骨缺损,     

复合软骨修复材料支架的构建

目的：构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法：对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果：天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论：通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。     

两种自制支架材料对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响

目的 评定两种自制支架材料DL－聚乳酸支架，聚磷酸钙纤维对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响。方法 采用材料样品与体外单层培养关节软骨细胞直接接触法，并对其进行倒置显微镜观察，培养细胞计数与DAN含量及其细胞外基质^35S掺入量和羟脯氨酸含量测定。结果 两种支架材料可与培养关节软骨细胞完全相容，无关节软骨细胞毒性；对培养关节软骨细胞的DNA，蛋白多糖及胶原合成无异常影响。结论 两种支架材料具有良好的关节软骨细胞相容性，对其功能物质的合成无异常影响，经其结构与性能优化，即可满足关节软骨组织工程制备的各项要求。     

I 型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体。方法将人脂肪干细胞与I型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率。结果脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖。结论I型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体。     

软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质体外相容性的研究

目的探索以异体软骨微粒脱细胞基质为支架构建组织工程化软骨。方法多步骤酶法将绵羊关节软骨制成微粒脱细胞基质,行大体、光镜(苏木素伊红、胶原、甲苯胺蓝染色)、扫描电镜观察,同时测定微粒的胶原、氨基葡聚糖、DNA含量。异体绵羊关节软骨细胞分离、体外扩增,并与软骨微粒脱细胞基质混合体外培养0～35d,倒置显微镜及扫描、透射电镜观察,同时测定羟脯氨酸,氨基葡聚糖,DNA含量及细胞黏附率。结果软骨微粒脱细胞基质只含有基质成分,直径0.100～0.154mm,胶原,氨基葡聚糖及DNA含量分别为204.4±3.1μg/mg,18.3±2.0μg/mg和0.042±0.013μg/mg。异体软骨细胞紧紧围绕于异体软骨微粒脱细胞基质四周,二者形成的复合物中胶原、氨基葡聚糖及DNA含量于第7d与0d相比具有统计学意义(P<0.05),分别与14d(胶原、DNA)和21d(氨基葡聚糖)达高峰,随后维持在高水平。细胞黏附率为92%。结论软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质有良好的生物相容性,为组织工程方法再造软骨提供又一支架材料。     

新型生物玻璃支架细胞相容性的实验研究

目的探讨新型生物玻璃支架BG-20的细胞相容性,为组织工程支架材料的选择提供依据。方法将骨髓基质干细胞（BMSc）与BG-20体外复合培养,进行形态学观察、细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）测定。结果BMSc能贴附在BG-20上,增殖、生长不受影响,且BG-20有一定的促细胞增殖的作用。ALP测定结果BG-20组与对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论BG-20具有良好的细胞相容性,能作为BMSc的载体用于组织工程骨的构建。     

壳聚糖制作组织工程软骨支架的研究

目的:探讨在动物体内,利用新型生物材料壳聚糖制作软骨组织的可行性。方法:在体外,将培养的兔关节软骨细胞,种植于多聚赖氨酸包埋的壳聚糖支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行标本观察,HE染色,检测软骨内DNA含量。结果:制备的复合支架成形良好,交联后的机械强度明显提高。结论:壳聚糖适合细胞的贴附生长,可作为间充质干细胞的载体。