抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ｃＤＮＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。结果表明，ｐ１６原核表达载体构建成功并表达出ｐ１６非融合蛋白。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

GST－IL－1融合基因表达的研究

为研究基因表达的影响因素，将人白细胞介素－１（ＩＬ－１）ｃＤＮＡ的不同片段分别重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ中ＧＳＴ基因３￣’端，形成ＧＳＴ－ＩＬ－１融合基因，经ＩＰＴＧ诱导后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果发现ＧＳＴ与全长８１６ｂｐ完整的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因未见有相应蛋白质的表达，且亦未见ＧＳＴ的表达，而ＧＳＴ与５￣’端缺失１８９ｂｐ的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因则看到有相应蛋白质的表达，表达量占细菌蛋白总量的３０％．表明ＩＬ－１ｃＤＮＡ５￣’端１～１８９ｂｐ的序列影响了整个融合基因的表达，即目的基因中远离翻译起始码ＡＵＧ的下游序列也可显著影响该基因的表达．此结果为基因工程中克隆基因表达调控的研究提供了有益的资料     

血管生成抑制素的功能结构域K1-3的融合表达与抗体制备

目的;重组表达ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ的功能结构域Ｋ１－３,并制备抗体,为其作用机理研究打下基础。方法：设计引物,通过ＰＣＲ以人纤溶酶原ｃＤＮＡ为模板扩增出Ｋ１－３基因片段,克隆至ｐＧＥＸ－４Ｔ－１融合表达载体,ＩＰＴＧ诱导,挑出表达克隆,切下基因片,克隆至ｐＵＣ１９进行序列测定,保留序列完全正确的克隆并进行诱导表达,从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上切下表达的蛋白条带作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并以Ｗｅｓ     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭素基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，培养上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测，ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ，表达上清的抗凝血酶活力为４７ＡＴＵ（ＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎＵｎｉｔ）／ｍｌ。结论：在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑制作用     

抑癌基因MTS1真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系HO-8910中的表达

目的：构建多肿瘤抑制基因１（ＭＴＳ１）的真核表达载体,将其转入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中,并得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞的影响奠定实验基础．方法：利用ＢａｍＨⅠ与ＥｃｏＲⅠ从ｐＵＣ１９－ｐ１６质粒上切下ＭＴＳ１ｃＤＮＡ片段并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,构建成ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６;利用脂质体（Ｆｕ－ＧＥＮＥＴＭ６）介导的基因导入法将ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６导入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中;采用ＡＢＣ法对转染后的不同代数细胞进行免疫细胞化学检测,观察ｐ１６蛋白的表达．结果：成功构建了ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并进行酶切鉴定;转染后经Ｇ４１８筛选２ｗｋ出现阳性克隆８９１０－ｐ１６,并检测到其中有ｐ１６蛋白的稳定表达．结论：成功构建ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并可在人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中得到稳定表达．     

水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭不基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，增减上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测，ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ，表达上清的抗凝血酶和为４７ＡＴＵ／ｍｌ。结论：在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑     

大鼠肾皮质受体相关蛋白克隆基因重组表达质粒的构建及分子生 …

运用ＤＮＡ重组技术，将用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白３１９个氨基酸的核苷酸序列导入载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和表达载体ｐＧＥＸ中，分别构建了重组质粒ｐＢＳＫ９ＲＡＰ和ｐＧＥＸ－９ＲＨ７，转化入大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ和ＤＨ５α中，经ＩＰＴＧ，ｘ＝ｇａｌ抗生素筛选阳性克隆，扩增后，重组质粒用限制性内切酶图谱分析及ＤＮＡ测序分析，证明插入了方向正确，表达阅读框架正确。     

鼠抗人TNF-α单域抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

ＲＴ－ＰＣＲ法获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α单克隆抗体Ｅ６轻,重链可变区基因序列,分别构建融合表达载体ｐＧＥ６ＶＨ和ｐＧＥ６ＶＬ,利用大肠杆框图 系统表达ＶＨ和ＶＬ单域抗体蛋白。方法：将ＲＴ－ＰＣＲ法获得的Ｅ６ＶＨ和Ｅ６ＶＬ基因分别克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中,使它们受控于Ｐｔａｃ启动子,转化大肠杆菌ＤＨ５α,经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,１００ｇ／ＬＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的 克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）基因,并使其在原核细胞中获得表达。方法 先从人胚胎肝脏中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ获得编码氨基端１９５个氨基酸残基的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ。将该片段亚克隆至ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ克隆质粒中,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ插入到原表达质粒ｐＥＴ２８－ａ中,转化大肠杆菌ＢＬＲ２１（ＤＥ３）,进行诱导表达,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法及免疫印迹法进行检测。结果 得到的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ与文献报道的序列完全一致。经诱导后ｈＴＰＯ基因在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占总菌体蛋白的１０％,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论 得到ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ,并在原核细胞中获得表达,得到截短形式的ｒｈＴＰＯ１９５。     

基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究

利用基因重组技术，成功地构建了ＭＤＲ Ｉ基因片断的表达载体ｐＧＥ－Ｈｍｄｒ－１，用氯化钙方法转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，挑选２０个克隆扩增培养，经提质粒，酶切，Ａｇａｒｏｓｅ电泳检测证实：其中４个克隆含有重组质粒，选用含重组质粒载体的菌株扩增培养，经ＩＰＴＧ诱导，超声波破碎，抽提蛋白，ＧＳＨ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测证实：此重组载体已表达所需的目的蛋白（ＧＳＴ－ｍｄｒ     

大鼠β-防御素rBD-1cDNA克隆

为开展β－防御素基因表达调控分子机制及其转基因防治粘膜感染的研究,作者克隆了大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ ｃＤＮＡ。从大鼠肾脏组织提取ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ,并重组到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ 载体,经限制性内切酶谱分析和ＤＮＡ序列测定,证实所克隆的ｃＤＮＡ片段为大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ ｃＤＮＡ。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

大鼠β—防御素rBD—1cDNA克隆

为开展β－防御素基因表达调控分子机制及其转基因防治粘膜感染的研究,作者克隆了大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ。从大鼠肾脏组织提取ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ,并重组到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,经限制性内切酶谱分析和ＤＮＡ序列测定,评定所克隆的ｃＤＮＡ片段为大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１融合型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达,并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端,构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）,可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统,一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据     

猴免疫缺陷病毒SIV核心蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ），直接从ＳＩＶ感染的猴艾滋病（ＳＡＩＤＳ）模型猴的外周血淋巴细胞总ＤＮＡ中扩增出７６７ｂｐ的ＳＩＶ核心蛋白Ｐ２７基因片段。扩增产物经ＥｃｏＲＩ及ＳａｌＩ双酶切后，克隆入相同酶切的表达质粒ｐＢＶ２２０中，获得含ＳＩＶ核心蛋白基因片段的重组质粒ｐＢＶＳＧ，并进行ＤＮＡ序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ经筛选、增殖及４２℃温度诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白１４．５％，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实表达产物能被ＳＩＶＰ２７单克隆抗体及ＳＡＩＤＳ模型猴血清中特异性抗体识别。