川芎茶调散加减合针刺艾灸序贯治疗椎动脉型颈椎病50例临床疗效观察

椎动脉型颈椎病（CSA）是颈椎病引起椎基底动脉供血不足而出现的以头痛、眩晕、耳鸣,严重的可引起体位性猝倒等一系列症状的一种疾病。本人从2008年至今,对50例椎动脉型颈椎病患者用川芎茶调散加减合针刺艾灸序贯治疗临床疗效观察,效果良好,现报告如下。     

携载rhBMP-2微球的新型可注射自凝固复合人工骨的制备及特性研究

[目的]制备一种具有良好降解性和成骨活性、可注射的自凝固新型骨修复材料。[方法]制备携载rhBMP-2的聚乳酸与聚乙醇酸共聚物（PLGA）微球，并将其与rhBMP-2／磷酸钙骨水泥（CPC）复合，制备出rhBMP-2／PLGA微球／CPC复合人工骨。探讨了材料的特性，包括形貌、固化时间、抗压强度及反映材料体外降解速度的指标一体外降解液Ca、P浓度变化，测定复合材料rhBMP乏的释药速度及体外诱导MSCs细胞成骨分化的能力。[结果]与单纯CPC-rhBMP-2相比，复合材料的固化时间少量增加，抗压强度下降明显。体外降解速度及体外释药明显提高，释放的rhBMP-2具有骨诱导活性。[结论]rhBMP-2／PLGA微球／磷酸钙骨水泥新型复合人工骨是具有良好应用前景的骨修复材料。     

碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备

目的:从维甲酸诱导的白血病细胞系HL60中,克隆编码219个氨基酸的新基因restin,构建原核表达载体、制备抗血清并进行初步应用。方法:采用PCR技术,以维甲酸诱导的白血病细胞的cDNA为模板,扩增出restin的编码区。将其克隆入大肠杆菌表达载体中。经过温度诱导获得restin表达蛋白。利用SDS-PAGE纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备该蛋白的抗血清。以该抗体做间接免疫荧光,初步观察restin在COS-7细胞内的表达分布。结果:大肠杆菌中表达的restin蛋白的Mr为26000。将其初步纯化后免疫新西兰白兔制备的抗血清,用Westernblot检测其效价为1∶800。间接免疫荧光显示,restin蛋白主要分布在细胞核内。结论:成功地制备抗restin的抗体,为进一步研究restin蛋白在组织中的表达、细胞内亚定位以及信号转导通路提供了前提条件。     

重组人骨形成蛋白—2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

利用大肠杆菌系统高效表达人骨形成蛋白－２成熟肽。方法；将编码人骨形成蛋白２成熟肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体ｐＤＨ上，使其受控于ＰＲＰＬ启动子，构建成表达质粒ｐＤＨＢ２ｍ，以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，表达产物初步纯化后进行复性处理，用小鼠肌袋模型检测产物诱骨活性。     

pcDNA3-hBMP2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 将hBMP2的cDNA连入真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,在脂质体介导下,将其导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3）。通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养4周,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果 经原位杂交和免疫组织化学证实,转染 pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。结论 在脂质体介导下,hBMP2基因能够导入成纤维细胞内并在其内获得稳定表达。     

pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力

背景：能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用？ 目的：观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达，同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织，利用X线观察其成骨情况。 设计、时间及地点：观察对比实验。实验于2004-11/2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。 材料：6只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，体质量2.0~3.0 kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品，pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。 方法：从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2，从成年兔股骨抽取骨髓，密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞，将细胞分成4组：A组：pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选；B组：pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选；C组：给予pcDNA3空载体转染；D组：仅加入脂质体转染试剂Fugene 6。 主要观察指标：①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达，分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中，移植4周后应用X射线观察成骨情况。 结果：①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100%瞬间表达BMP2。②基因转染4周后，A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后，X射线可显示新骨形成。 结论：pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞，通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。     

人牙髓细胞与牙龈成纤维细胞差异表达基因的克隆及特征分析

目的批量克隆人牙髓细胞（HDPC）与人牙龈成纤维细胞（HGF）的差异表达基因并对其特征进行分析，研究HDPC的生物学特性。方法体外培养HDPC和HGF，应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF的cDNA消减文库，批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序，使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较。结果经过序列测定，获得12个差异表达基因的序列，经BLAST分析有2个为未知基因。在已知基因中，含有4个与细胞信号转导机制相关的基因；2个与细胞转运机制相关的基因（包括细胞膜及细胞核膜转运）；2个与细胞RNA剪接机制相关的基因。结论HDPC的生物学特性是由某些特定基因的差异表达所决定的，其生长、分化机制可能与相对旺盛的蛋白合成及分泌活性相关。     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的     

rhBMP-2对成纤维细胞成骨表型的影响

目的：研究rhBMP－2对成纤维细胞成骨表型的影响,探讨成纤维细胞成骨条件,方法：向体外培养的成纤维细胞（NIH3T3细胞）内加入不同浓度的rhBMP-2,在第3日和第6日检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素表达,绘制生长曲线,结果：rhBMP-2可增加成纤维细胞ALP活性,促进骨钙素表达,在rhBMP－2浓度为800ug.mL^-1和1200ug,mL^-1作用最强,rhBMP-2对细胞增殖规律无明显影响,结论：rhBMP－2可促进成纤维细胞成骨表型表达。     

人骨形成蛋白2,3成熟肽削短/突变体的构建与表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白［1］(bone morphogenetic proteins, BMPs)是属于TGF-β超家族的成员,目前已有18个hBMP基因被克隆. 除BMP-1外,其他BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用［2-4］,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景. 利用E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性［5,6］,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系,尚未见报道. 在上述工作的基础上,本研究在大肠杆菌中表达削短和突变的hBMP-2,3成熟肽,测试其活性,以探索其结构与功能的关系,并期望为获得更好的新型的基因工程hBMP2,3提供依据,为深入研究hBMP-2,3生物活性的分子机制和临床应用打下基础.