一个编码4个不同基因RNAi的shRNA质粒的构建及其对CNE-2Z细胞增殖、凋亡和小鼠鼻咽癌移植瘤的影响

目的：构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因的shRNA真核表达质粒,研究其对人鼻咽癌细胞系CNE-2Z的干扰作用。方法：根据VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因序列,各设计2条寡核苷酸序列,合成互补DNA链,插入真核表达质粒pGenesil-1中,同时构建单基因（VEGF）质粒pGenesil-2。分别转染CNE-2Z细胞,分为多基因质粒（P-1）组和单基因质粒（P-2）组,并设空白对照（BC）组和阴性对照（NC）组。采用MTT法检测细胞增殖活性。采用实时定量PCR和Western-blot检测4种基因在人鼻咽癌细胞系CNE-2Z中的表达。体内裸鼠成瘤实验观察单基因和多基因质粒干预对肿瘤的抑制作用。结果：通过酶切和测序证实重组真核表达载体构建正确。MTT显示细胞增殖受到抑制,且多基因质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因质粒。目的基因在mRNA和蛋白水平上表达均下降。裸鼠实验显示P-1组抑制肿瘤细胞增长的作用要强于P-2组。结论：成功构建一个载体编码4个不同基因的shRNA质粒载体系统。转染鼻咽癌细胞后,与单独沉默VEGF相比,同时干扰VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因可以更好地抑制细胞增殖。     

人AQP1-shRN A 表达质粒载体的构建与筛选

目的：构建针对人水通道蛋白1（AQP1）基因的shRNA表达质粒载体,并验证其干扰效果,为进一步探讨AQP1基因对人乳腺癌细胞的作用及机制建立基础。方法设计合成4对针对人AQP1基因不同位点的shRNA片段,通过DNA重组技术将其插入载体GV115中,构建AQP1‐shRNA重组质粒,转染人乳腺癌MCF‐7细胞,并通过实时荧光定量 PCR（RT‐PCR）和Western blot法检测干扰效率。结果 RT‐PCR法证实AQP1在乳腺癌 MCF‐7细胞中有表达。测序验证表明4对靶向AQP1‐shRNA表达载体均构建成功。4组干扰载体能够从基因和蛋白表达水平不同程度抑制 AQP1表达,其中以AQP1‐shRNA 4对AQP1的干扰效率最强。结论成功有效地构建了针对人AQP1基因的shRNA重组质粒,能够有效抑制人乳腺癌细胞MCF‐7中A Q P1的表达。     

RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建

目的：利用pEGFP6-1和pGenesil—1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA（shorthairpinRNA,shRNA）串联表达的载体pEGFP6-1—siFasl＋siFas2,进一步通过BDAdeno—X系统构建腺病毒表达Fas—shRNA载体。方法：设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil—1中,酶切pEGFP6-1—siFasl大片段和酶切pGenesil—1—siFas2小片段,经T4DNAI,igase连接得到pEGFP6-1—siFasl＋siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pshuttle2穿梭质粒。经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFasl＋siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5a,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno—siFasl＋siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果：构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确：经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论：成功构建Fas—shRNA腺病毒串联表达载体。     

Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

目的：构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法：化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot 技术检测MCF-7细胞和Hela 细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制（P<0.05）,两组之间无明显差异（P>0.05）。结论：Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。     

抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响

目的研究抑癌PTEN基因联合p53基因转染对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响。方法构建表达载体：空质粒pEGFP—N1、pEGFP—N1-PTEN质粒、pEGFP—N1-p53质粒及pEGFP—N1-PTEN—p53质粒,体外分别转染到前列腺癌Pc-3m细胞中,观察它们转染后的荧光表达情况;采用RT—PCR法检测目的基因表达;Westernblotting法检测目的PTEN蛋白和P53蛋白的表达;用MTT法观察细胞增殖抑制情况并绘制生长抑制曲线;AnnexinV—FITC／PI双染流式细胞术检测PTEN基因和p53基因对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响。结果荧光显微镜下观察到PTEN、p53及两个基因同时在PC-3m细胞系中成功表达;RT—PCR检测结果显示,与PTEN基因单转染组、p53基因单转染组和空载体转染组相比联合转染组mRNA在PC-3m细胞系中表达明显增加俨〈0．05）;Westernblotting法检测同样发现,联合转染组PTEN蛋白及P53蛋白表达明显高于PTEN基因单转染组、p53基因单转染组和空载体转染组俨〈0．05）;联合转染组细胞凋亡率明显高于空载体转染组、PTEN基因单转染组和p53基因单转染组（P〈0．05）。结论PTEN基因与p53基因联合转染能诱导前列腺癌PC-3m细胞凋亡．这种联合转染可能对前列腺癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经...     

RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长

目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝（MTF）法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为（87．13±2．21）％;RT．PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64．55％和51．24％,均较随机序列构建载体的阴性对照（pGenesil-1-NC）组和空白对照组明显下调（均P〈0．05）;MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低（均P〈0．05）;体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB／C裸鼠人鼻咽癌的生长（均P〈0．05）。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。     

短发夹RNA对头颈肿瘤细胞端粒酶活性和增殖的影响

目的:观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的短发夹RNA(shRNA)对喉癌Hep-2细胞株和鼻咽癌NEC细胞株端粒酶活性和生长增殖影响,探讨抑制端粒酶活性途径治疗头颈肿瘤的可行性。方法:根据hTERT cDNA序列构建表达shRNA、含荧光素基因、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒shRNA1和表达shR-NA的、含荧光素基因的、靶向非人类基因的真核表达质粒shRNA2。分别以质粒shRNA1、shRNA2、转染试剂及空白培养液处理体外培养的Hep-2细胞和NEC细胞。转染48 h后以TRAP PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性并行HE染色;倒置显微镜下每天观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖活性。结果:①Hep-2细胞和NEC细胞shRNA1处理48 h后与空白对照组比较端粒酶活性下降,P<0.05。②HE染色发现shRNA1处理后Hep-2和NEC细胞胞体缩小、核固缩,同等培养条件下,细胞生长密度变稀,见许多圆形死亡细胞。③与相应时间点空白对照组细胞平均吸光度(A)值比较,shRNA1处理组Hep-2细胞和NEC细胞24,48,72 h A值均减小,P<0.05。结论:靶向hTERT mRNA的小干扰RNA能够显著降低Hep-2细胞和NEC细胞的端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖,并诱导细胞凋亡。     

shRNA抑制人骨髓间充质干细胞SMN1基因表达的研究

目的 构建在哺乳动物细胞中表达SMN1 shRNA的质粒,并初步探讨其对人骨髓间充质干细胞全长SMN mRNA及蛋白的抑制作用,为进一步建立脊髓性肌萎缩症细胞模型提供实验依据。方法 根据GenBank中SMN1 cDNA序列设计5条SMN1靶向shRNA并将其克隆至pRNAT-156．1／Neo载体中U6启动子的下游,形成能在细胞内表达SMN1特异性短发夹状RNA的重组质粒pshRNA-SMN1;在脂质体介导下将重组质粒pshRNA-SMN1转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）,RT-PCR、Western印迹分别检测fl-SMNmRNA及fl-SMN蛋白的表达。结果 琼脂糖凝胶电泳及DNA测序证实重组质粒pshRNA-SMN1构建成功,其中pshRNA-SMN1-1组和pshRNA-SMN1-4组转染后明显抑制了hMSCsfl-SMNmRNA及蛋白的表达（均P〈0．05）,在mRNA水平上千扰效率分别为64．05％、61．04％,蛋白水平上干扰效率分别为52．97％和61．57％,而未影响△7-SMN mRNA的表达。结论 构建的pshRNA-SMN1重组质粒能有效地抑制人骨髓间充质干细胞fl-SMNmRNA及蛋白的表达。     

发卡样CTGF特异性RNA干扰重组体的构建及筛选

目的：利用Pgenesil 1质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，并筛选有效的抑制序列。方法:分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子的质粒载体Pgenesil 1中，构建重组体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。将构建成功的4组重组体转染HSC T6 24?h后，通过半定量RT PCR分析HSC T6 CTGFmRNA的表达水平，与空白对照及仅加转染试剂组比较分析。结果:CTGF的shRNA片段被成功克隆到Pgenesil 1质粒载体中，经酶切与测序证实构建成功，转染HSC T6 24?h后，与空白对照组相比，通过半定量RT PCR分析发现有两组细胞CTGFmRNA水平明显下降，24?h抑制效率分别为(74±5)%,(P<0.01);(61±3)%,(P<0.05)。转染非特异shRNA组及仅加转染试剂组CTGFmRNA表达水平无明显变化。结论:成功构建了能表达CTGFshRNA的3组重组体，并筛选出能高效抑制CTGF表达的shRNA序列，为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了实验基础。     

干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。     

携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法：利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的表达。结果：PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3400、110和720 bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4300 bp。测序分析,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论：成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。     

大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况?方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中?在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6 shRNA?结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功?Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率?结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础?     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定

目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1．0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。     

NogoB-shRNA表达质粒的构建及其在大鼠原代肝星状细胞收缩中的作用

目的 构建针对大鼠NogoB基因的shRNA表达质粒,并初步探究其在大鼠肝星状细胞（HSCs)收缩功能中的作用。 方法 设计并合成针对大鼠NogoB基因3个不同位点的shRNA,通过DNA重组技术,将shRNA插入pSuper质粒中,构建NogoB-shRNA重组质粒,转染至大鼠原代肝星状细胞(HSCs)中,并通过Real-time PCR技术检测基因的相对表达量,筛选出能沉默大鼠NogoB基因的重组质粒,再通过Western blot加以验证,同时观察NogoB基因被抑制后,HSCs中内皮素1（Endothelin-1,ET-1)受体A、受体B（ETA、ETB）表达水平的变化。 结果 构建的3对重组质粒中,NogoB-shRNA2对NogoB的基因的表达具有明显的抑制作用。NogoB基因被抑制后,大鼠HSCs中ETA的表达无明显变化,ETB的表达升高,ETA/ETB的水平降低。 结论 成功构建了有效、特异的抑制大鼠NogoB基因表达的shRNA表达质粒,并初步观察到NogoB在肝星状细胞的收缩中可能有一定作用。