结核分枝杆菌耐药基因快速检测

目的 探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR-SSCP技术对122株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测，即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后进行SSCP分析。结果 以结核分枝杆菌H37RV为对照，48株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100.0％，74株同时耐链霉素和利福平的耐药株中，59株(79.7％)有rpsL基因图谱异常；69株(93.2％)有ropB基因图谱异常。结论 ropB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐利福平和链霉素的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌链霉素和利福平耐药性。     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

耐多药结核分支杆菌突变基因检测

目的：研究耐多药结核分支杆菌耐药分子机制,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法,方法：通过16S rRNA聚合酶链反应单链的构象多态性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)方法对30株耐多药分离株和20株药物敏感株进行初步分子菌种鉴定。通过PCR－SSCP分析30株耐多药结核病临床分离株的rpoB,katG,rpsL基因。结果：经16S rRNA PCR-SSCP菌种鉴定,所分析菌株均为结核分支杆菌;30株耐多药分离株经SSCP分析,56．7％存在rpoB基因突变,43．3％有katG基因突变,91．3％有rpsL基因突变,结论：rpoB,rpsL,katG基因突变分别是结核分支杆菌耐利福平,链霉素,异烟肼的分子机制,耐多药结核病是药物靶基因突变所致。通过PCR－SSCP可简便,快速地检测大部分耐多药结核病的耐药基因。     

PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度的相关性

目的 研究结核分枝杆菌，rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度强弱之间的关系。方法应用绝对浓度法测定58株结核分枝杆菌对4种－线抗结核药物的药敏特性，对耐利福平结核分枝杆菌的耐药谱进行分析。同时对含有核心突变区的结核分枝杆菌，rpoB基因片段进行PCR扩增和DNA测序，分析rpoB基因突变与多重耐药的关系，以及突变位点和突变性质与利福平耐药强弱的相关性。结果58株结核分枝杆菌中，利福平耐药株36株，敏感株22株。36株耐药株均存在，rpoB基因突变，其中88．9％(32／36)至少对利福平和异烟肼同时耐药。90．O％的利福平高度耐药株(18/20)与rpoB基因531位和526位密码子突变相关。密码子531位和526位各有1株双碱基突变，且均为多重耐药株。结论结核分枝杆菌，rpoB基因突变所致的利福平耐药株大部分对异烟肼耐药，因此单独检测rpoB基因突变即可初步筛选多重耐药的结核分枝杆菌；而rpoB基因的突变位点与利福平耐药程度之间具有一定的相关性。     

耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

目的建立快速检测耐多药结核分枝杆菌的分子药敏方法，掌握盐城、南通地区结核分枝杆菌KatG及rpoB基因的突变特点，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分枝杆菌耐INH、RFP直接检测的可行性。方法对收集的47例耐INH、RFP的结核分枝杆菌临床痰分离株行PCR-自动测序法检测KatG及rpoB基因突变，以结核分枝杆菌标准株H37Rv为参比菌株，应用BACTEC460TB快速培养系统进行自动培养、药敏。结果47例耐INH、RFP分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29／47、39／47，两者同时突变率为47％。结论PCR-直接测序法敏感、特异，是可快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变，适合于临床肺结核患者MDR—TB痰标本耐药性的快速检测。     

结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测

目的：探讨编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变与结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药性的相关关系。方法：根据结核分枝杆菌genebank中katG序列，自行设计特异性寡聚核苷酸引物，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析和直接测序法(direct sequencing，DS)分析结核分枝杆菌中katG基因突变情况．以H37，Rv标准株为对照。结果：所有23株敏感菌均未有SSCP结果异常；35株耐药菌中，有2株(5．7％)katG基因扩增阴性，且发生在高度耐药菌中．进一步分析发现，SSCP法突变检出23株(65．7％)，测序法突变检出24株(68．6％)，符合率为95．8％(23／24)．结论：参照测序法对耐药菌突变序列的分析结果，PCR-SSCP敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌katG耐药基因突变，有利于耐药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

PCR-SSCP检测耐多药结核菌基因与细菌培养结果对比分析

目的应用PCR-SSCP检测常规及BACTEC培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌临床分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,分析其敏感性和特异性,评价其在检测结核分枝杆菌耐药性方面的价值和临床实用性。方法22株常规培养和8株BACTEC培养检出的高浓度及低浓度耐INH、RFP、SM耐多药结核分枝杆菌分离株,分别用PCR-SSCP检测KatG、rpoB、rpsL基因,观察其电泳条带,并与结核菌标准株H37RV对比。结果22株常规培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌分离株中,KatG、rpoB、rpsLPCR扩增产物,用SSCP分别检出KatG基因16株(72.7%)、rpoB基因19株(86.4%)和rpsL基因14株(63.6%)。8株BACTEC培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌分离株中分别检出KatG基因5株(62.5%),rpoB基因6株(75%)、rpsL基因5株(62.5%)。综合两者KatG、rpoB和rpsL基因检出率分别为70.0%(21/30)、83.3%(25/30)和63.3%(19/30)。高浓度耐药与低浓度耐药分离株中的检出率有显著差异(P<0.05),常规培养与BACTEC培养分离株中的检出率无显著差异(P>0.05),与结核菌标准株H37RV电泳条带对比,特异性为100%,敏感性97%。结论PCR-SSCP敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌的KatG、rpoB和rpsL基因,可用于耐多药结核分枝杆菌的临床检测。     

浙江省耐药结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变特点研究

目的 了解浙江省耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变特点.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv为对照,应用聚合酶链反应--单链构象多态性(PCR-SSCP)技术、聚合酶链反应--直接测序(PCR-DS)技术检测100株耐药结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB、embB基因.结果 经PCR-DS检测katG基因突变率达54.8%,以Ser315Thr突变最常见(40.3%);在耐利福平菌株中,rpoB基因突变率达88.9%,以526、531位氨基酸改变最常见,总突变率达77.8%(63/81);在耐乙胺丁醇菌株中,embB基因突变率达60%,以Met306VaI改变最常见(28.9%).结论 PCR-SSCP技术操作简单、检测快速,可作为临床耐药检测的辅助手段;浙江省结核菌耐药基因突变位点同国内研究基本一致,各位点突变形式所占比例有自身特点.     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的：探讨耐多药结核病（MDR－TB）临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术分析了同时耐异烟肼（INH），利福平（RFP），链霉素（SM）的多耐药临床分离株和35株药敏感株的rpoB,KatG,rpsL基因突变，结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，35株药物敏感株的rpoB,rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％，KatG基因有2株图谱异常，特异性为94％，71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB,KatG,rps基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明，36株多耐药临床分离株中，32株rpoB基因图谱异常，21株KatG基因图谱异常，26株rpsL基因图谱异常，其敏感性分别为rpoB(89%),KatG(58%),rpsL(72%)，结论：结核分支杆菌耐RFP，INH，SM耐药性的产生主要是由于rpoB,KatG,rpsL基因突变所致，PCR－SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

PCR—SSCP快速检测脊柱结核耐药基因

目的 了解临床脊柱结核耐药情况 ,探讨耐药基因PCR-SSCP对临床的应用价值.方法 43例脊柱结核患者结核肉芽组织应用BacT/ ALERT 3D结核分支杆菌快速培养系统培养,所得临床分离株行药敏试验,对耐药基因katG、r p s L行PCR-SSCP.结果 43例结核肉芽组织标本培养后19例阳性,其中6株存在不同程度耐药 ,总耐药率为31%.耐异烟肼株 katG突变率为 10% ,耐链霉素株 rpsL突变率为21% , 耐药基因检测平均用时为14h.结论 PCR-SSCP可快速检测脊柱结核耐药基因,与常规药敏试验结合可更能准确地反应脊柱结核患者的耐药情况.     

Detecting katG Drug Resistant Genetic Mutation among pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis in Mycobacterium tuberculosis L-forms by PCR-SSCP

Objective：To study the relationship between mutation in the katG gene and drug resistance of INH in Mycobacterium tuberculosis L-forms among patients of pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis, and to explore the clinical application of PCR-SSCP. Methods： A total of 52 clinical isolated strains of Mycobacterium tuberculosis L-forms were collected. Mutation in the katG genes was detected by PCR-SSCP and traditional antimicrobial susceptibility test （AST）. Results： The results by AST showed that there were 40 persisters in 52 clinical isolated strains. The drug resistant rate was 76.92%（40/52）, and the gene mutation rate of katG was 57.70%（30/52）by PCR-SSCP, the difference was no quite significance （X^2 = 2.8507, P 〉 0.05）. The coincidence rate of two methods was 75.00% （30/40）. Conclusion： The detectionrate of katG resistant strains in Mycobacterium tuberculosis L-forms was high by PCR-SSCP. The combined application of PCR-SSCP and traditional antimicrobial susceptibility test can improve the detecting rate.     

Detecting drug resistant genetic mutation among pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis in Mycobacterium tuberculosis L-forms application of PCR-SSCP technique in Huainan mining district

Objective： To study the relationship between drug resistant genetic mutation and drug resistance in Mycobacterium tuberculosis L-form, discuss the internal relationship between drug resistances and drug-resistant related genes and explore the value of PCR- SSCP to clinical application. Methods： A total of 52 clinically isolated strains of tuberculosis L-form were collected among 97 pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis. The gene mutations of katG, rpoB and rpsL were detected by PCR-SSCP, and the results were compared with those analyzed by traditional antimicrobial susceptibility test（AST）. Results： The gene muta- tion rates of katG, rpoB and rpsL by PCR-SSCP were respectively 57.70% （30/52）, 65.38% （32/52） and 40.38% （21/52）. The rate of reversion was 78.85%（41/52） and the result of drag-resistant genes was invariable. The results of AST showed that there were 40 （76.92%） multi-drug resistant strains in 52 clinically isolated strains. The number for three-drug resistant strain was 21 （40.38%） and that of two-drug resistant was 19（36.54%）, but only 12（23.08%） strains were one drug resistant. The rate of total drug-resistance was 100%, but there were 15 strains of allied mutation of three genes, 16 of two mutations and 6 of only one by PCR-SSCP. The coincidences were respectively 71.43%, 84.12% and 50.00%. Then there was no significant difference between the allied mutations of multi-drug resistant gene and the mutations of only one drug resistant gene （P 〉 0.05）. Conclusion： PCR-SSCP technique has a higher sensibility and specificity to detect the genes of katG, rpoB and rpsL in tuberculosis L-form among pneumoconiosis complicated with tuberculosis,and the detecting rate of two drug resistant strains and three drug resistant strains was higher. The combined application of PCR-SSCP and AST has advantages at earlier diagnosis and guidance of clinical medications.     

结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：探讨快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测了20株异烟肼(INH)敏感的结核杆菌临床分离株，20株INH耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分支杆菌H37RV作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，20株INH耐药株中19株观察到katG基因扩增产物。以H37RV标准株为对照，20株敏感株SSCP带谱与对照相同；19株INH耐药株中8株与对照相同，11株有不同程度的差异，INH耐药katG基因突变或缺失的阳性率为60％。结论：多数结核分支杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致，用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

荧光PCR熔解曲线法对痰样本结核分枝杆菌耐药性检测价值及耐药特征分析

目的：评估荧光PCR熔解曲线法（熔解曲线法）检测肺结核患者涂阳痰样本结核分枝杆菌（MTB）对一线抗结核药物耐药性价值及耐药特征分析。方法：收集涂阳且培养阳性肺结核患者痰样本和相应MTB菌株各142例,采用熔解曲线法检测痰样本MTB对抗结核药物链霉素（SM）、异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）耐药情况,同时采用液体药敏法对相应MTB菌株耐药性检测,对两种检测结果行方法学比较。结果：以液体药敏法为标准,熔解曲线法检测痰样本MTB对4种抗结核药物耐药性结果差异无统计学意义（P>0.05）,熔解曲线法检测SM、INH、RFP、EMB耐药性的敏感度分别为：78.57% (11/14),70.00% (14/20),100.00% (12/12),71.43% (5/7);特异度分别为：92.97%(119/128),96.72%(118/122),97.69%(127/130),100%(135/135);两者符合率分别为：91.55%(130/142),92.96%(132/142),97.89%(139/142),98.59%(140/142);Kappa值分别为：0.601,0.696,0.877,0.826。结论：与传统液体药敏检测相比,熔解曲线法检测痰样本MTB对抗结核药物SM、INH、RFP、EMB的耐药性效能一致,特异度和符合率均较高。该法对结核患者涂阳痰样本MTB耐药性检测有较好临床参考价值。     

结核分支杆菌耐利福平耐药基因检测研究

目的评价应用DNA序列分析方法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用DNA序列分析法和PCR-SSCP法对80株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株32株,耐RFP或含耐RFP耐多药株48株)rpoB基因核心区域的突变情况进行检测.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,所有32株药物敏感株的rPOB基因均无突变.用DNA序列分析方法检测48株耐药株中44株发生突变,敏感性为91.7%(44/48),其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸.PCR-SSCP检测48株耐RFP分离株中,45株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为93.1%(45/48).结论DNA序列分析可指导临床用药,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性.     

北京市复治结核病患者非北京基因型菌株谱系及耐药分析

目的 了解北京市复治结核病患者非北京基因型菌株谱系及耐药情况,为复治非北京基因型结核病患者有效防治提供科学依据。方法 采用RD105基因缺失法对复治患者所分离的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）进行检测,筛查出非北京基因型菌株,使用可变数目串联重复序列基因分型实验分析非北京基因型菌株的遗传特征,再使用比例法药敏实验及全基因组测序分析其耐药情况。结果 134例复治结核病患者所分离的MTB中,北京基因型为 125例（93.3%）,非北京基因型为9例（6.7%）。9例非北京基因型MTB呈现9种不同的基因型,均不成簇,为独特型。9例非北京基因型MTB均为谱系4,其中,亚谱系L4.4有4株,亚谱系L4.5有5株。耐药预测结果显示,9例非北京基因型中,6例为全敏感菌株（66.7%）,1例单耐异烟肼,耐药突变位点为ahpC_c.-48G>A,1例同时耐异烟肼与乙硫异烟胺, 耐药突变位点为fabG1_c.-15C>T,1例单耐氟喹诺酮,耐药突变位点为gyrA_p.Asp94Asn与gyrA_p.Ala90Val。全基因组测序预测耐药结果与比例法药敏结果完全一致。结论 复治结核病患者非北京基因型菌株主要为谱系4,呈明显的多态性。耐药突变位点均为常见突变位点。     

耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG、inhA基因的突变

目的 探讨耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的特征,为临床选择抗结核药物治疗提供实验室参考。方法 回顾性分析2015年1月1日-2017年1月1日在上海交通大学附属同仁医院海南分院的260例患者标本,对213例进行结核分枝杆菌分离培养,对47例进行博奥芯片法检测,再对213例培养所得菌株进行博奥芯片检测,对博奥芯片检测的47例痰标本进行结核分枝杆菌分离培养;对101株结核分杆菌进行katG与inhA基因检测。结果 培养法和博奥芯片结核分枝杆菌检出率分别为36.6%（78/213）和48.9%（23/47）;培养法和博奥芯片耐多药结核分枝杆菌检出率分别为41.0%（32/78）和47.8%（11/23）;博奥芯片法和比例法耐异烟肼符合率98.7%(77/78);男性结核分枝杆菌阳性率45.9%高于女性阳性率29.2%;检测katG基因和inhA基因,3个基因区域都发生突变,突变发生率大小依次为katG315（AGC→ACC）密码子(32株,54.2%)、katG315（AGC→AAC）密码子(16株,27.1%)、inhA-15（C→T）(10株,16.9%)。24株(23.8%,24/101)对异烟肼无突变但对利福平发生突变;43株也同时耐利福平(42.6%,43/101)。突变频率较高的突变位点是315,突变频率为81.4%(48/59),1株(1.7%,1/59)为双位点联合突变且突变频率最低。结论 结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐INH相关,这为临床及时准确诊断、及早使用抗结核药物联合治疗提供了帮助。