结核病金标法免疫学诊断临床应用研究

本介绍的金标法结核抗体诊断药盒．应用特异性膜抗原，点样于硝酸纤维膜，运用间接法原理检测结核抗体，具有特异性强、敏感性高等特点，全程操作仅2分钟，是目前世界上结核病诊断最快捷的方法。     

结核分支杆菌耐药性快速测定方法及其评价

近年来 ,结核分支杆菌 (ＭＴＢ)耐药性问题日趋严重 ,已成为结核病控制的三大难题之一。由于传统的耐药性测定方法需时较长 ,远不能满足临床治疗的需要。因此 ,寻找快速、准确的耐药性测定方法已成为结核基础研究领域的一个重要课题 ,也是临床实践中亟待解决的问题[1,2 ] 。文中就耐药性快速测定的几种新方法研究进展综述如下。一、耐药性的表型检测方法1 快速培养仪检测系统 :该检测系统主要利用快速培养仪及Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ 7Ｈ9液体培养基来快速测定ＭＴＢ的耐药性。目前 ,所用的快速培养仪主要有ＢＡＣＴＥＣ ＴＢ 96 0、Ｂａｃ…     

吡嗪酰胺耐药性结核分枝杆菌的噬菌体检测技术研究

目的 建立噬菌体生物扩增法（PhaB）快速测定吡嗪酰胺耐药性，并探讨其在结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性测定中的应用价值。方法 应用建立的PhaB测定108株结核分枝杆菌临床分离株的吡嗪酰胺耐药性，并与绝对浓度法的药敏结果进行比较，对不符合的菌株进行最低抑菌浓度（MIC）测定和序列测定分析。结果 PhaB检测吡嗪酰胺耐药性的最佳测定条件为pH值5．5、药物浓度200μg／ml、37℃作用48h。用绝对浓度法检测108株结核分枝杆菌临床分离株，其中吡嗪酰胺敏感33株、耐药75株；用PhaB检测该108株结核分枝杆菌临床分离株，若以噬菌斑减少95％为判断标准。则吡嗪酰胺敏感32株，耐药76株。2种方法检测均为敏感的为28株，均为耐药的为71株，符合率为91．7％；2种方法检测结果不符的为9株，其中5株的PhaB结果与MIC结果相符，4株的结果不符，测序结果表明9株中有7株的PhaB结果与测序结果相符。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准，PhaB检测吡嗪酰胺耐药性的敏感性为94．7％，特异性为84．8％，阳性预测值为93．4％，阴性预测值为87．5％，准确性为91．7％。结论 PhaB测定吡嗪酰胺耐药性简便、快速，3d即可获得药敏结果，可作为吡嗪酰胺耐药性的快速筛选方法。     

16SrDNA结合显色法芯片技术鉴定分枝杆菌的方法学研究

目的建立16SrDNA结合显色法芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)鉴定分枝杆菌的方法。方法利用GenBank中细菌16SrDNA保守区序列,设计两对分枝杆菌属特异性通用引物,采用双重PCR法同时扩增16SrDNA的2个不同片段;根据已知16种分枝杆菌的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针。先用通用引物PCR扩增所有标准菌株DNA,PCR产物分别与16种分枝杆菌探针的玻璃芯片杂交,通过尼龙膜显色进行分析。结果应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准菌株和5种非分枝杆菌菌株,对其双重PCR、杂交、洗涤条件进行优化。确定双重PCR最佳退火温度为52℃,在该温度下除5株非分枝杆菌外均产生2条DNA片段,大小分别为272～280bp和183～192bp;杂交温度32℃、2×SSC洗涤5min、0.2×SSC洗涤1min,16种分枝杆菌的杂交效果最好,特异性达100%。结论用显色芯片法检测16SrDNA,可准确鉴别16种分枝杆菌。     

焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌四种药物耐药性

目的 利用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星的耐药性,并对其临床应用进行评价.方法 收集上海市肺科医院2008-2009年临床确诊的肺结核患者的痰标本培养阳性结核分枝杆菌89株.所有菌株按<结核病诊断实验室检验规程>进行分枝杆菌培养、菌种鉴定.另外10株已知药敏结果的结核分枝杆菌来自上海市肺科医院菌株库.利用焦磷酸测序技术,以10株已知药敏结果和经直接测序已知耐药基因突变情况的结核分枝杆菌为试验菌株,探索焦磷酸测序检测结核分枝杆菌rpoB、katG、gyrA、rrs耐药基因的最佳模式,并用该条件检测89株结核分枝杆菌临床分离株,检测结果与Bactec 960药敏法进行比较.结果 rpoB、gyrA基因检测宜采用焦磷酸测序序列分析模式,katG、rrs基因检测宜采用焦磷酸测序单核苷酸多态性模式.以Bactec 960药敏法测定结果为判断标准,则焦磷酸测序法检测89株结核分枝杆菌临床分离株对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星耐药性的敏感度分别为98.0%、64.1%、79.5%、78.3%,特异度分别为97.5%、100.0%、90.0%、100.0%,准确性分别为97.8%、77.5%、85.4%、94.4%,该法检测利福平、氧氟沙星、阿米卡星的检测结果与Bactec 960药敏检测结果一致性较好,Kappa值均≥0.7.结论 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星耐药性具有快速、准确、高通量的优点,是一种可对结核分枝杆菌多种药物耐药性进行快速检测的方法.

Abstract：

Objective To develop an assay to determine Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin, isoniazid, ofloxacin and amikacin by pyrosequencing and evaluate the value of this method in clinical application. Methods Eighty-nine clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from tuberculosis patients were collected from Shanghai Pulmonary Hospital during 2008 to 2009. All strains were isolated from decontaminated sputum, cultured on Lowenstein-Jensen media and identified by traditional biochemical tests with standard methods. Ten Mycobacterium tuberculosis were selected from the strain bank of Shanghai Pulmonary Hospital. The optimal conditions of detection of rpoB, katG, gyrA and rrs gene by pyroseuencing were determined, using the 10 Mycobacterium tuberculosis strains whose drug susceptibility of Bactec 960 and sequence of rpoB, katG, gyrA, rrs gene were known. Then the drug susceptibility of 89 Mycobacterium tuberculosis clinical isolate strains were detected by pyrosequencing using this conditions and the results were compared with that of the Bactec 960 methods. Results The pyrosequencing program of sequence analysis was suitable for the detection of the mutations of rpoB and gyrA genes, and the program of single nucleotide polymorphism was suitable for katG and rrs genes. Among the 89 Mycobacterium tuberculosis clinical isolates,when using the drug susceptibility of Bactec 960 as the standard, the sensitivity of rifampin, isoniazid,ofloxacin and amikacin is 98.0%, 64. 1%, 79.5%, 78. 3% respectively, the specificity is 97.5%,100. 0%, 90. 0%, 100. 0% respectively, the accuracy is 97.8%, 77. 5%, 85.4%, 94. 4% respectively,tested by pyrosequencing. The results of the detection of resistance to rifampin, isoniazid, ofloxacin and amikacin in Mycobacterium tuberculosis using pyrosequencing technique were almost the same with that of Bactec 960, and Kappa ≥0. 7 in each detection. Conclusion Pyrosequencing is thus a rapid, accurate and high throughput method for detecting Mycobacterium tuberculosis resistance to these four drugs.     

结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性四种测定方法的比较

目的探讨噬菌体生物扩增(PhaB)、Bactec-960、最低抑菌浓度(MIC)和基因芯片方法在结核分枝杆菌(MTB)异烟肼(INH)耐药性测定中的应用价值。方法应用4种方法检测167株MTB临床分离株INH耐药性，并比较测定结果的敏感性、特异性和准确性。结果Bactec-960检测敏感株111株，耐药株56株。若以Bactec-960测定结果为判断标准，则PhaB的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为96．4％、96．4％、93．1％、98．2％和96．4％；MIC的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为92．9％、99．1％、98．1％、96．5％和97．0％；基因芯片的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为83．9％、96．4％、92．2％、92．2％和92．2％。若以MIC测定耐药性结果为判断标准，则PhaB检测INH耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100％、95．6％、91．4％、100％和97．0％；Bactec-960的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为98．1％、96．5％、92．9％、99．1％和97．0％；基因芯片的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为88．7％、96．5％、92．2％、94．8％和94．0％。结论PhaB检测INH耐药性具有很高的敏感性和特异性，与Bactec-960及MIC的符合率很高，只需3d时间，且操作简便、不需特殊仪器设备，可作为MTB的INH耐药性快速筛选方法。MIC测定INH耐药性结果与Bactec-960符合率较高，是否用于INH耐药性测定的判断标准有待进一步研究。基因芯片检测INH耐药性敏感性偏低，只能作为参考方法。     

痰噬菌体生物扩增法检测一线抗结核药物敏感性的临床应用研究

目的 观察噬菌体生物扩增(phab)法测定痰样本结核分枝杆菌的药物敏感性在临床应用的效果.方法 应用phab法检测143例涂阳肺结核患者痰样本中的结核分枝杆菌对一线抗结核药物的敏感性,并根据检测结果及时调整化疗方案,随访这些患者的痰菌转阴情况和临床疗效,与同期住院未行phab法检测的菌阳肺结核患者进行回顾性地对比.均数的比较采用成组t检验;计数指标采用卡方检验进行对比,其中若出现值为0时采用四格表精确检验法.结果 143例涂阳肺结核患者phab法检测的阳性率为94.4％( 135/143),三类患者的阳性率比较差异无统计学意义(x2=1.886,p＞0.05).phab组患者痰送检至获得药敏检测结果的时间为(6.6±1.8)d,对照组为(29.4±8.7)d,差异有统计学意义(t=29.01,p＜0.01).Ⅱ类肺结核患者中,phab组的2个月转阴率(63.2％ vs.35.1％,x2 =3.989,p＜0.05)和总治愈率较对照组高(100％ vs.78.4％,p＜0.05).Ⅰ类和Ⅲ类肺结核患者的phab组和对照组在转阴率和治愈率方面比较无明显差异.结论 phab法检测痰样本中的结核分枝杆菌药敏结果对涂阳肺结核的方案制订具有较好的指导意义. abstract： objective to evaluate clinical application of phage amplified biologically assay (phab) in susceptibility test of mycobacterium tuberculosis (mtb) in sputum. methods the drug susceptibility of mtb was detected by phab in 143 patients with sputum-positive pulmonary tuberculosis (ptb),and the chemotherapy regimens were adjusted according to the results of susceptibility test.independent samples t-tests were used for comparison of means.count numbers were compared with chisquare test.if there were count number of 0,fisher probabilities should be used.results the total positive rate of phab was 94.4％ (135/143) with no differences between three types of ptb (x2 =1.886,p ＞ 0.05 ).the duration of testing for phab group was (6.6 ± 1.8) days,while for control was (29.4 ±8.7) days (t =29.01,p ＜ 0.01 ).compared with control group,the 2-month negative-conversion rate (63.2％ vs.35.1％,x2 =3.989,p ＜ 0.05 ) and cure rate ( 100％ vs.78.4％,p ＜ 0.05 ) of phab group in type Ⅱ patients were significantly higher.but there were no differences between phab and control groups in type Ⅰ and Ⅲ ptb patients.conclusion the results of phab drug susceptibility test can be helpful for choosing effective chemotherapy regimen for ptb patients rapidly.     

结核分枝杆菌北京基因型菌株新型分子遗传标志的鉴定

目的分析结核分枝杆菌北京基因型菌株与非北京基因型菌株间差异表达的蛋白质，寻找可用于快速区分北京基因型的分型标志。方法应用间隔寡核苷酸分型法对56株结核分枝杆菌进行基因分型，经双向电泳技术比较北京基因型菌株与非北京基因型菌株的全菌蛋白表达图谱差异，差异表达的蛋白质通过基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱仪进行质谱分析，蛋白质数据库进行检索。进而对差异表达的蛋白质相应基因及上游进行序列分析。结果56株结核分枝杆菌中有49株为北京型菌株，7株为非北京型菌株。两个基因型菌株中差异明显表达的蛋白质为Rv0927c，该蛋白质斑点在49株北京基因型菌株中均缺失，而在7株非北京菌株和H37Rv中均有出现。北京基冈型菌株Rv0927c基因有两个特征性突变：在421位核苷酸位点的AGC3个碱基缺失，以及该基因上游127位点G—A的突变；而非北京基因型菌株该基因及其上游序列与H37Rv完全相同。结论 Rv0927c基因在北京基因型菌株中的特征性突变，对开发新型区分北京基因型和非北京基因型结核分枝杆菌的方法奠定了基础。     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐药性

随着耐药结核病患者的不断增加,氧氟沙星(Ofloxacin,OFLK)等氟喹诺酮类抗结核分枝杆菌MTB的药物被广泛应用,对OFLX的耐药呈上升趋势.早期检测OFLX的耐药性对临床用药具有指导作用.氟喹诺酮类药物主要作用靶位是菌体的DNA解旋酶,该酶由gyrA和gyrB基因分别编码的A和B亚基组成.     

噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌阿米卡星耐药性方法的建立及应用评价

目的 建立结核分枝杆菌阿米卡星(Am)耐药性的噬菌体生物扩增法(PhaB)快速检测技术,并探讨其临床应用价值。 方法 通过不同菌量及药物浓度的筛选,建立PhaB测定结核分枝杆菌阿米卡星药敏检测方法;用该方法对108株结核分枝杆菌临床分离株进行了阿米卡星药敏检测,同步进行Bactec MGIT 960的Am药敏检测,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果不符合的菌株测定其Am的最低抑茵浓度(MIC)。 结果 以细菌接种量10^-3 mg／ml、药物浓度2 μg／ml、37℃作用48-h为药敏最佳检测条件,噬菌体检测108株结核分枝杆菌临床分离株阿米卡星敏感82株、耐药26株,Bactec MGIT 960检测敏感80株、耐药28株;2法测定均为敏感79株、均为耐药25株。以Bactec MGIT 960测定结果为判断标准,则PhaB的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值及符合率分别为89.3%、98.8%、96.2%、96.3%、96.3%。 结论 PhaB检测结核分枝杆菌的Am耐药性有较高的敏感性、特异性和准确性,整个检测只需3 d,且操作简单、不需特殊仪器设备,可作为 M .TB临床分离株Am药敏快速检测备选方法之一。