耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因，了解利福平耐药的分予机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物．用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段，对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定，比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB举因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变，突变位点主要为531、516或526常见密码子，且绝大多数为单碱基突变，发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基岗及其突变，结核分枝杆菌埘利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

应用基因芯片技术检测耐利福平结核分枝杆菌基因型

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，用TAMRA标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的片断，与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果240株结核分枝杆菌临床分离株中，55株全敏感株和66株耐其他药物的利福平敏感株的PCK—SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同；119株耐RFP临床分离株中DNA芯片杂交有117株检测到rpoB基因突变，其中111株单位点突变，78株为531住密码子TCG→TTG（Ser→Leu）、TCG→TGG（Ser→Trp）和TCG→TAC（Ser→Tyr）突变；24株为526位蓉码子CAC→TAC（His→Tyr）、CAC→GAC（His→Asp）、CAC→CCC（His→Pr0）、CAC→CTC（His→Leu）和CAC→CGC（His→A职）突变；4株为516住客码子GAC→GTC（Asp→Val）和GAC→GGC（Asp→Gly）突变；3株为533位密码子CTG→CCG（Leu→Pro）突变；1株为511位密码子CTG→CCG（Leu→Pro）突变；1株为513位密码子CAA→AAA（Gln→Lys）突变；6株为双位点突变，其中3株511和516位联合突变，2株533和515住联合突变，1株517位密码子CAG→CAC（Gln→His）和518位密码子AAC→GAC（Asn→Asp）联合突变。DNA测序结果与DNA芯片杂交结果完全一致。1株516位GAC—TAC（Asp→Tyr）突变的分离株及1株516位GAC—TAC（Ssp→Tyr）和518住AAC—CAC（Asn→His）联合突变的分离株DNA芯片检测阴性，是因为芯片上无相应的探针。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

结核分枝杆菌链霉素耐药基因突变特征分析

目的 了解广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌rpsL、rrs基因突变特征。方法 对137株链霉素耐药、166株链霉素敏感的结核分枝杆菌临床分离株应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增rpsL、rrs基因片段,并进行测序、分析比对。结果 137株链霉素耐药菌株中, 118株存在rrs或者rpsL基因突变,突变率86.13%;其中92株存在rpsL基因突变（突变率为67.15%）,主要分布在43位氨基酸（70株）与88位氨基酸（20株）,其中43位氨基酸突变类型为K→R（AAG→AGG,49.64%）和K→T（AAG→ACG,1.46%）,88位氨基酸突变类型为K→R（AAG→AGG,13.14%）、K→T（AAG→ACG,0.73%）和K→Q（AAG→CAG,0.73%）,并有2株存在39、43位氨基酸的联合突变,即T→T（ACC→ACT）联合K→T（AAG→ACG）突变（1.46%）; 47株存在rrs基因突变（突变率为34.31%）,包括8种核苷酸突变,主要分布在1401位A→G（13.14%）、514位A→C（8.76%）、517位C→T（6.57%）,2株存在514、1401位核苷酸A→C;A→G的联合突变;15株存在rpsL与rrs基因的同时突变;166株链霉素敏感菌株中,7株存在rpsL基因突变,13株存在rrs基因突变。结论 广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌株的rpsL、rrs基因突变具有其自身特点,存在地域差异。     

广西百色地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的突变特征分析

目的分析百色地区结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。方法收集128例结核病患者痰液标本,采用改良罗氏培养基分离培养结核分枝杆菌,绝对浓度法检测利福平耐药性,PCR技术检测耐药结核分枝杆菌rpoB基因序列并测序分析利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。结果分离培养获得98例MTB,98例MTB出现36株利福平耐药,耐药率为36.73%,36株耐利福平菌株中有27株rpoB基因发生突变,基因突变率为75.00%,其中516位点突变率为3.70%(1/27),531位点突变率为59.26%(16/27),526位点突变率为29.63%(8/27),533位点突变率为7.41%(2/27)。突变热点依次为rpoB531、rpoB526和rpoB533。结论百色地区耐利福平结核分枝杆菌耐药性产生的主要分子机制是因为rpoB的基因发生突变。     

微流芯片技术在耐药株结核杆菌检测中的应用

目的：探讨微流芯片技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变的可行性。方法：根据rpoB基因最为常见的三种突变形式(531TCG→TTG，526CAC→TAC，516GAC→GTC)设计引物，用于微流芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药性，同时与常规药敏试验和DNA测序结果进行比较。结果：引物比例1：5，杂交温度52℃，杂交时间10min为最佳条件。在20株常规药敏试验为利福平敏感株中，微流芯片测出2株耐药株，并经DNA测序证实；而28株药敏试验为利福平耐药株中，1株微流芯片测定为敏感株，DNA测序证实为513位CAA→CTA突变。该法与常规药敏试验和DNA测序的总符合率分别为93.8％（45/48）和97.9％（47/48）。结论：微流芯片技术快速、灵敏、准确，可用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌耐利福平基因的研究

目的用DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌耐药基因,为临床诊治提供实验依据。方法收集2013年6月—2015年6月1 005份痰标本,采用直接涂片检测结核分枝杆菌情况,阳性样本分别用改良罗氏培养基培养和DNA微阵列芯片法进行鉴定,分析耐药基因情况。结果 1 005份痰标本的涂阳率为40.3%(405/1 005)。DNA微阵列芯片法的阳性率为98.0%(397/405),明显高于改良罗氏培养基培养法(44.2%,179/405),P0.01。DNA微阵列芯片法结果显示,有90株(24.9%,90/361)结核分枝杆菌发生利福平耐药,其中33株(占36.7%)发生单纯rpo B基因突变,54株(占60.0%)发生rpo B和kat G基因突变,3株(占3.3%)发生rpo B和inh A基因突变;rpo B基因最常见的突变位点依次为531、526、516、511,突变频率分别为44.4%、25.6%、10.0%、5.5%;突变频率最高的三种突变类型依次为:531位点(C-T)占54.0%(29/90),531位点(C-G)占11.1%(10/90)及526位点(C-T)占11.1%(10/90);单位点突变和二位点联合突变分别有81株(占90.0%)和9株(占10.0%)。结论 rpo B基因突变是导致肺结核患者RFP耐药的分子基础,其突变位点呈多样性。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度的相关性

目的 研究结核分枝杆菌，rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度强弱之间的关系。方法应用绝对浓度法测定58株结核分枝杆菌对4种－线抗结核药物的药敏特性，对耐利福平结核分枝杆菌的耐药谱进行分析。同时对含有核心突变区的结核分枝杆菌，rpoB基因片段进行PCR扩增和DNA测序，分析rpoB基因突变与多重耐药的关系，以及突变位点和突变性质与利福平耐药强弱的相关性。结果58株结核分枝杆菌中，利福平耐药株36株，敏感株22株。36株耐药株均存在，rpoB基因突变，其中88．9％(32／36)至少对利福平和异烟肼同时耐药。90．O％的利福平高度耐药株(18/20)与rpoB基因531位和526位密码子突变相关。密码子531位和526位各有1株双碱基突变，且均为多重耐药株。结论结核分枝杆菌，rpoB基因突变所致的利福平耐药株大部分对异烟肼耐药，因此单独检测rpoB基因突变即可初步筛选多重耐药的结核分枝杆菌；而rpoB基因的突变位点与利福平耐药程度之间具有一定的相关性。     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的：探讨耐多药结核病（MDR－TB）临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术分析了同时耐异烟肼（INH），利福平（RFP），链霉素（SM）的多耐药临床分离株和35株药敏感株的rpoB,KatG,rpsL基因突变，结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，35株药物敏感株的rpoB,rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％，KatG基因有2株图谱异常，特异性为94％，71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB,KatG,rps基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明，36株多耐药临床分离株中，32株rpoB基因图谱异常，21株KatG基因图谱异常，26株rpsL基因图谱异常，其敏感性分别为rpoB(89%),KatG(58%),rpsL(72%)，结论：结核分支杆菌耐RFP，INH，SM耐药性的产生主要是由于rpoB,KatG,rpsL基因突变所致，PCR－SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

结核分枝杆菌耐药基因检测

目的：研究结核分枝杆菌耐药的分子机制，建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应、ＰＣＲ－单链构象多态性、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性分析ＭＴ临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ＫａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果：ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－１０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ经物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的种特异性。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ与Ｐ     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术鉴别结核分枝杆菌利福平耐药基因

目的:采用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆茵rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌对RFP耐药性测定方面的临床价值.方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分别检测48株RFP药物敏感和耐药结核分支杆茵临床分离株,先用PCR扩增rpoB基因,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变,并与药敏结果做对照分析.结果:48株结核临床分离株中11株RFP敏感株SSCP带谱均与对照相同,37株砌RFP耐药株中有3株带谱与对照相同,另34株SSCP带谱与对照有不同程度的差异.48株临床分离株的L-J药敏法与SSCP的平行分析结果对比,PCR-SSCP方法检测RFP耐药结核菌的敏感性为91.90%,特异性为90.90%.结论:PCR-SSCP技术可快速准确检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,此技术可用于临床结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测,以及时指导临床合理选用敏感抗结核药物.     

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分...     

河南省耐多药结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的突变特征

目的:分析河南省耐多药(MDR)结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。方法:收集150株MDR结核分枝杆菌,应用PCR扩增利福平耐药相关基因rpoB编码区全长并测序,以结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA序列为参比序列,分析菌株的突变特征。结果:MDR菌株rpoB基因编码区存在突变者占97.2%(140/144),突变在利福平耐药决定区(RRDR)内者占96.5%(139/144),RRDR内和RRDR外同时存在突变者占99.3%(139/140);突变热点依次为rpoB531、rpoB526和rpoB516。发现未被记录的15个突变位点和4个突变类型,其中rpoB1284位点突变可能是多态性位点,与利福平耐药无关。结论:检测河南地区结核分枝杆菌rpoB基因RRDR内位点的突变可预测MDR结核分枝杆菌的耐药性。     

结核分枝杆菌利福平耐药突变基因检测与BD960药敏的对比

目的 分析对比结核分枝杆菌利福平PCR-反向点杂交法耐药基因突变位点检测和BACTEC MGIT960 System表型药敏结果的相关性。方法 同时对220例住院患者的痰或肺泡灌洗液 (BALF) 用PCR-反向点杂交法检测利福平耐药基因突变位点与BACTEC MGIT 960 System检测利福平表型药敏结果进行对比分析。结果 2种方法检测利福平药敏结果符合205例, 特异度93% (205/220) ;2种方法检测利福平都敏感的有172例;基因耐药, 表型耐药的有33例, 其中有3例检出rpo B基因H526位点突变, 突变率9%;基因耐药, 表型敏感的有15例, 其中有11例均检出rpo B基因H526位点突变, 突变率73%。结论 PCR-反向点杂交法检测具有快速高效、特异度高等特点, 对临床诊断、治疗有指导意义。     

耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

目的：建立快速检测耐多药结核分枝杆菌的分子药敏方法，掌握南通地区结核分枝杆菌KatG及rpoB基因的突变特点，探索结核分枝杆菌耐异烟肼、利福平直接检测的可行性。方法：收集47例耐异烟肼、利福平的结核分枝杆菌临床分离株行PCR结合DNA直接测序法检测KatG及rpoB基因突变。以结核分枝杆菌标准株H37Rv为参比菌株，应用BACTEC460TB快速培养系统进行结核分枝杆菌自动培养、药敏。结果：47例耐异烟肼、利福平分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29例(61．7％)、43例(91．5％)，两者同时突变26例(55．3％)。结论：PCR-直接测序法敏感、特异、可靠实用，可快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变，用于临床耐多药结核快速检测。     

体外诱导获取利福平耐药结核分枝杆菌菌株及其稳定性研究

目的:利用浓度倍增方法体外诱导对利福平(rifampicin,Rfp)耐药的结核分枝杆菌(mycobacteriurn tu-berculosis,MTB)菌株,研究耐药机制演变过程及遗传稳定性.方法:将MTB标准菌株H37Rv在Rfp浓度2倍递增的7HIO液体培养基中进行传代培养,逐步诱导MTB菌株对Rfp耐药.利用...     

91株耐利福平结核分枝杆菌的rpoB基因突变分析

目的分析利福平耐药结核菌株rpoB基因突变特点,探讨DNA序列分析在药敏测定中的意义。方法对101株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的PCR产物进行测序分析,观察其rpoB基因突变的规律。结果 101株临床分离株中,耐利福平91株,经DNA序列分析有85.71%(78/91)菌株存在rpoB基因突变的突变,主要集中在531位(44.87%)和526位(28.21%),未检测到发生缺失或插入碱基突变的菌株,10株敏感株均无突变。结论 rpoB基因核心突变区发生突变是结核分枝杆菌对利福平耐药的主要原因,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

rpoB基因不同突变位点结核分枝杆菌利福平体外最小抑菌浓度的变化

目的 探讨rpoB基因不同突变位点结核分枝杆菌利福平体外最小抑菌浓度(MIC)的变化.方法 收集人型的结核分枝杆菌菌株103株,利用基因芯片法筛选rpoB耐药突变基因菌株.采用绝对浓度法对所有菌株进行不同浓度的利福平药敏试验,观察不同菌株对利福平的MIC.结果 基因芯片共分离出55株rpoB突变株,48株非突变株.突变株MIC值为(459.6±205.8)μg/ml,高于非突变株的(5.0±4.5)μg/ml(P ＜0.05).55株rpoB突变株中突变位点分别为531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T),531(C→T)位点突变株的MIC值为(576.0±29.3)μg/ml,均高于516(A→G/T)的(432.9±38.2) μg/ml和526(C→G/T)的(355.5±59.5) μg/ml(P＜0.05),但526(C→G/T)、516(A→G/T)位点突变株的MIC比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 基因芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变株与其耐药表型相关性较高.不同突变位点的结核杆分枝菌菌株对利福平的耐药程度有差异,可为临床合理用药提供参考.