高侵袭力人胃癌细胞亚系MKN-28s的建立

目的以穿透人工基底膜的能力大小为依据筛选具有体外高侵袭能力的胃癌细胞亚系。方法用体外培养法收集扩增能侵袭穿透人工基底膜的胃癌细胞亚系;比较母亚两系的侵袭能力;流式细胞术检测母亚两系细胞周期;免疫组织化学SP法观察母亚两系细胞Flt-4蛋白表达情况。结果从母系MKN-28中成功筛选出高侵袭力胃癌细胞亚系MKN-28S;显微镜下细胞计数示亚系侵袭至膜背面的数量较母系明显增多（P〈0.05）,细胞侵袭力增强;亚系中Flt-4蛋白表达同母系相比显著增高;亚系增殖指数（PI）高于母系。结论MKN-28S细胞较MKN-28细胞具有更强体外侵袭力和增殖能力。     

人胃癌高低侵袭转移潜能细胞系对化疗药物敏感性的比较研究

目的探讨肿瘤细胞侵袭转移能力的改变对肿瘤细胞化疗敏感性的影响。方法Westem blotting法比较筛选出的人胃癌细胞MKN-28S（亚系）与MKN-28（母系）中E-Cadherin、MMP-2蛋白表达；transwell体外侵袭实验比较两系侵袭潜能。采用MTT法比较两系对阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、紫杉醇（PTX）4种化疗药物的敏感性。结果筛选出亚系的E-Cadherin蛋白表达与母系相比显著减弱、而MMP-2蛋白表达则显著增强；显微镜下细胞计数示亚系侵袭至基质胶膜背面的数量较母系明显增多（P〈0．05）；MTr示两系对5-Fu、ADM、MMC的敏感性差异有显著性（P〈0．05），而两系对PTX的敏感性差异无显著性（P〉0．05）。结论肿瘤细胞侵袭转移能力的改变可以影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，同一遗传背景下的高侵袭转移亚系较母系耐药性更强。     

人胃癌细胞MKN-28母亚两系转移相关基因的筛选

目的采用基因芯片技术比较筛选前后的人胃癌细胞母系MKN-28和亚系MKN-28S之间的基因表达谱,利用生物信息学方法筛选出与胃癌侵袭和转移相关的差异基因。方法用肿瘤转移基因芯片筛选出人胃癌细胞MKN-28母亚两系的转移相关基因,对部分有差异表达的基因用RT-PCR和Western blot进行分析鉴定。结果用肿瘤转移基因芯片筛选出两系的差异表达基因共20个,其中上调基因13个,下调基因7个。选择其中有代表意义的2个基因利用RT-PCR和Western blot进行验证,证实所选基因在筛选前后瘤细胞中均有差异表达,与基因芯片的表达情况一致,说明基因芯片结果可信度较高。结论基因芯片技术是筛选胃癌转移相关基因的有效方法;多基因参与了胃癌的侵袭和转移的过程,包括一些基因如Flt-4、SRC等基因和其它相关基因的改变。     

裸鼠高转移性胃癌细胞亚系的筛选及其肝细胞生长因子受体表达

目的 筛选具有较高转移能力的胃癌细胞亚系并从该细胞亚系肝脏重要生长因子受体表达变化这一角度初步探讨肝转移能力与肝脏微环境之间的关系。方法 通过复制裸鼠胃移植瘤模型及对该模型所产生的肝转移灶进行原代培养，获取具有较高转移潜能的胃癌细胞亚系，并应用免疫组化方法对母系与亚系细胞中重要肝细胞生长因子受体(bFGFR，TGFβR，c—Met)表达的情况进行检测。结果 通过两轮筛选，从母系SGC-7901中筛选到高转移潜能胃癌细胞亚系SGC-7901LM2。该亚系中c—Met表达同母系相比有显著增高。结论 高转移胃癌细胞亚系的筛选有利于胃癌肝转移的进一步研究，c—Met表达可能有助于SGC-7901LM2肝转移能力的增强。     

ARHI真核表达质粒对胃癌恶性表型的影响

目的 观察外源ARHI在胃癌细胞中过表达对胃癌细胞增殖、迁移以及侵袭的影响.方法 构建pEGFP-ARHI表达载体,并通过lipofectamineTM 2000将其转入ARHI低表达的胃癌细胞系MKN-28中作为实验组,空载质粒pEGFP-N1转入MKN-28作为空载组,未处理MKN-28细胞作为未处理组.通过荧光显微镜及Western blot检测外源ARHI的表达,采用增殖实验、损伤刮擦实验、体外侵袭实验(Transwell小室)分别检测过表达ARHI胃癌细胞MKN-28的增殖能力、侵袭和迁移能力的变化.结果 ARHI在胃癌细胞系MKN-28中表达较低,成功构建重组真核表达质粒pEGFP-ARHI并成功转染MKN-28细胞后,CCK8法检测显示,相对于空载组和未处理组,转染pEGFP-ARHI的实验组细胞增殖变慢(P＜0.05),Transwell小室实验显示实验组细胞侵袭能力减弱(P＜0.05),细胞划痕实验表明实验组细胞迁移能力减弱(P＜0.05).结论 在ARHI低表达的胃癌细胞系MKN-28中表达重组质粒pEGFP-ARHI能够抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力.     

抑制GM130表达对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的 分析GM130在不同分化人胃癌细胞系的差异表达,利用小干扰RNA技术来沉默GM130基因,研究其对胃癌细胞生物学行为的影响.方法 体外培养3株不同分化程度胃癌细胞系(高分化MKN-28、中分化SGC-7901、低分化MKN-45),Western blot和RT-PCR筛选出高表达的GM130细胞株MKN-45、SGC-7901,设计并化学合成、转染、筛选出针对GM130的小干扰RNA片段.通过MTF、Transwell、Matrigel侵袭实验,观测下调GM130后对胃癌细胞株的生物学行为影响,Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的变化.结果 Western blot和RT-PCR检测结果显示,在MKN-45、SGC-7901细胞中GM130蛋白和mRNA水平呈现高表达水平.Westem blot和qRT-PCR结果显示在低分化胃癌MKN-45细胞中,GM130-siRNA-519转染组GM130基因的表达水平显著抑制(P＜0.05).与对照组相比,抑制转染组细胞的增殖、迁移能力明显下降,穿膜细胞数明显减少,MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平显著降低(P＜0.05).结论 抑制GM130基因的表达下调可显著降低胃癌细胞的增殖和体外侵袭转移能力.     

血小板增高对胃癌细胞增殖和转移的影响及临床意义

目的 探讨血小板增高在胃癌组织中表达的临床意义及其对胃癌细胞增殖和转移能力的影响.方法 收集山东大学附属济南市中心医院胃癌组织及其配对癌旁组织各60例,通过免疫荧光技术检测组织中血小板的表达,分别以不同数量的血小板与MKN-45细胞共培养后,采用 CCK-8 检测胃癌细胞的增殖情况,Transwell 实验观察胃癌细胞侵袭和迁移能力的变化.Western blot和ELISA检测血小板与细胞共培养后MKN-45细胞中的蛋白表达.结果 血小板在胃癌组织中的表达高于癌旁组织.血小板的表达与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴转移有密切的关系.CCK-8 和 Transwell结果表明,血小板显著加强MKN-45细胞的增殖能力和转移能力,且其均呈浓度依赖性.经共培养后,MKN-45细胞中E-cadherin的蛋白表达水平降低,N-cadherin和 VEGFA的蛋白表达水平增加.结论 血小板增高与胃癌的发生、发展和转移密切相关,血小板计数可作为恶性肿瘤的预后指标.     

外源性FHIT基因转染对人胃癌细胞系MKN-45迁移和侵袭能力的影响

目的：探讨脆性组氨酸三联体（FHIT）基因转染对人胃癌细胞MKN-45迁移和侵袭能力的影响。方法：将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT,转染至FHITmRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN-45,分别应用Millicell小室细胞迁移实验、Transwell小室侵袭实验检测转染前后MKN-45细胞迁移能力和侵袭力的改变。结果：外源性FHIT基因转染MKN-45细胞后,MKN-45细胞的迁移能力明显降低（P〈0.05）,但细胞侵袭能力无明显变化（P〉0.05）。结论：外源性FHIT基因转染致MKN-45细胞系的迁移能力明显降低,对MKN-45细胞系的侵袭能力无明显影响。     

皮质肌动蛋白在不同转移潜能乳腺癌细胞中的表达及意义

目的筛选不同转移潜能的乳腺癌细胞亚系,并探讨皮质肌动蛋白(cortactin)在乳腺癌细胞增殖和侵袭过程中的作用。方法经过连续人工基质膜侵袭实验后获得高、低转移潜能的乳腺癌细胞亚系,通过透射电镜观察比较两系细胞的超微结构,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测两系细胞增殖能力,流式细胞仪检测两系细胞周期,Transwell侵袭小室模型比较两系的迁移能力。应用免疫细胞化学法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹分析法检测cortactin蛋白在两系细胞中的表达。结果利用人工基质膜侵袭实验筛选出高、低转移潜能乳腺癌细胞亚系,并且两系细胞形态上无明显差异。MTT实验显示高转移潜能细胞体外生长速度显著快于低转移潜能细胞(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示,高转移潜能细胞亚系与低转移潜能细胞亚系相比,G0/G1期细胞前者比后者少[(52.67±3.69)%vs(64.46±2.79)%],而S期细胞前者比后者多[(30.53±6.19)%vs(24.63±2.04)%]。高转移潜能细胞亚系增殖指数(PI)高于低转移细胞亚系[(47.32±3.69)%vs(35.53±2.80)%,P0.05],侵袭能力显著强于低转移潜能细胞亚系[(61.46±7.08)vs(25.32±4.87)个/视野,P0.05]。免疫组化、RT-PCR和蛋白质印迹分析均显示在高转移潜能细胞亚系中cortactin在基因和蛋白水平的表达均高于低转移潜能细胞亚系(P0.05)。结论 Cortactin的过表达与乳腺癌的增殖和转移过程密切相关。     

虫草素抑制人胃癌细胞MKN-28运动侵袭能力研究

[目的]探讨虫草素对人胃癌细胞MKN-28体外迁移、侵袭能力的影响及其可能作用的分子机制。[方法]CCK8法检测虫草素对MKN-28细胞的增殖抑制作用,体外迁移、侵袭实验观察虫草素对人胃癌细胞MKN-28迁移、侵袭能力的影响,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测虫草素作用24 h后MKN-28细胞Ezrin蛋白,基质金属蛋白9(MMP9)信使核糖核酸(mRNA)表达变化。[结果]200~800μg/mL虫草素可明显抑制MKN-28胃癌细胞增殖,体外迁移实验显示虫草素组细胞划痕闭合约18%,对照组细胞划痕闭合约25%,而表皮生长因子(EGF)组闭合约48%。虫草素组显著低于另两组(P0.05)。体外侵袭实验结果表明虫草素组穿过人工基底膜的细胞数明显减少(P0.05);虫草素组Ezrin和MMP9的表达明显下调(P0.05)。[结论]虫草素可能通过下调Ezrin及MMP9表达抑制人胃癌细胞MKN-28细胞的迁移与侵袭能力,从而发挥其抑制肿瘤生长的作用。     

KISS-1和基质金属蛋白酶-9蛋白在胃癌中的表达及意义

目的探讨肿瘤转移抑制基因KISS-1及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与胃癌侵袭、转移的关系,为研究胃癌的转移机制及临床治疗提供理论基础。方法采用免疫组织化学法检测36例胃癌组织及36例正常胃黏膜组织中KISS-1及MMP-9蛋白的表达情况,分析其与胃癌患者各临床病理指标的关系及二者表达的相关性;采用Western blot法检测不同侵袭能力胃癌细胞株BGC-823(高侵袭)和MKN-28(低侵袭)中KISS-1和MMP-9蛋白的表达。结果KISS-1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率显著低于正常胃黏膜组织(P<0.05),并且其低表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05);MMP-9蛋白在胃癌组织中的阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织(P<0.05),并且其高表达与胃癌的浸润深度和淋巴结转移均密切相关(P<0.05);KISS-1与MMP-9蛋白的表达呈负相关(P<0.05)。KISS-1蛋白在高侵袭胃癌细胞株中的表达低于低侵袭细胞株,但差异无统计学意义(P>0.05);MMP-9蛋白在高侵袭胃癌细胞株中的表达高于低侵袭细胞株,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 KISS-1蛋白的低表达和MMP-9蛋白的高表达可能与胃癌的浸润、转移有关,二者有望成为判定胃癌侵袭和转移能力的指标。     

八聚体结合蛋白-4对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的：探讨八聚体结合蛋白-4（octamer-bindingprotein-4,Oct 4）在胃癌（gastriccarcinoma）组织及其4株细胞系（ MKN-28、SGC-7901、BGC-823和GES-1）中的表达,并分析其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法收集20例胃癌手术患者的癌变组织和20例正常组织,通过Real time PCR（ RT-PCR）和Western blot法检测Oct 4在胃癌组织及其4株细胞系中的表达水平。在干扰掉Oct 4后,采用MTT的方法检测BGC-823细胞的增殖活性,通过Transwell小室法检测BGC-832细胞的侵袭活性,利用Western blot法检测MMP-2及MMP-9的表达。结果 RT-PCR检测发现Oct 4 mRNA在胃癌组织中高表达,而在正常组织中低表达,Western blot法检测发现Oct 4在BGC-832表达水平最高。下调Oct 4的表达导致BGC-823细胞增殖和侵袭活性被抑制,MMP-2及MMP-9的表达水平均降低。结论 Oct 4在胃癌组织和胃癌细胞系中高表达,并且敲除Oct 4会导致胃癌细胞的增殖和侵袭活性明显减弱,降低MMP-2及MMP-9的表达水平。 Oct 4在胃癌组织中的过量表达有助于胃癌的临床诊断,同时Oct 4在胃癌的恶性肿瘤生物活性中发挥着重要作用。     

鼻咽癌细胞肝转移亚株的建立

目的 建立鼻咽癌细胞肝转移亚株,研究鼻咽癌肝转移机制。方法 利用裸鼠体内传代的方法获得肝转移细胞亚株,并用体内和体外实验来观察其侵袭转移能力。结果 经体内反复筛选得到肝转移能力高的亚株5-8F-H3B-EGFP．其侵袭性、运动性以及形成肝转移灶的能力均大于母系5-8F-EGFP,并具有较高的肝脏亲和性。结论 该亚株的建立为今后研究鼻咽癌肝转移的分子机制奠定了基础。     

Comparison between the gastric cancer cell line MKN-45 and the high-potential peritoneal dissemination gastric cancer cell line MKN-45P

Peritoneal metastasis is the most common form of recurrence in gastric cancer, and is associated with a poor prognosis. It is clear that many agents are involved at the various stages of this process, however, many aspects of the progression remain unclear. In the present study we compared the gastric cancer cell line MKN-45 with the high-potential peritoneal dissemination gastric cancer cell line MKN-45P, established from MKN-45. The supernatant of culture medium of MKN-45 cells or MKN-45P cells was collected, and the concentrations of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-8, hepatocyte growth factor (HGF), Transforming growth factor beta-β1 (TGF-β1), vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) proteins were measured using an enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) method. Invasion, wound healing and adhesion assays were performed in vitro to examine interstitial invasion, migration and adhesion in the gastric cancer cell lines. Moreover, Western blotting was performed to determine the expression of cyclooxygenase-1 (COX-1) and COX-2 proteins in the culture media of the cell lines. The concentrations of IL-6, IL-8, VEGF and MMP-2 protein in the culture supernatant of MKN-45P were significantly higher than those of MKN-45. Percent adhesion of MKN-45P was significantly higher than that of MKN-45 in the fibronectin-coated group. There was no significant difference in invasion or migration between MKN-45 and MKN-45P. COX-1 and COX-2 proteins were observed in both cell lines. These results suggested that secretion of IL-6, IL-8, VEGF and MMP-2 from cancer cells, and adhesion of cancer cells to fibronectin, were related to the establishment of peritoneal dissemination.     

鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2(R743)的建立及其差异表达蛋白的初步分析

目的 建立放射抗拒的人鼻咽癌(NPC)细胞株,探讨NPC细胞的放射抗拒机制.方法 应用X射线反复照射NPC CNE-2细胞,总剂量为51 Gy,筛选出放射抗拒的细胞株CNE-2(R743).采用克隆形成实验测定细胞的放射敏感性,流式细胞术检测细胞周期特征;采用双向凝胶电泳结合质谱分析法鉴定差异表达蛋白.结果 与CNE-...     

基质金属蛋白酶-9及其mRNA在胃癌中的表达与血管新生的关系

目的　观察基质金属蛋白酶 9(MMP 9)与MMP 9mRNA在胃癌组织及细胞中的表达与作用特点 ,及其与肿瘤浸润、转移及血管新生之间的关系。方法　利用 74例胃癌标本及体外培养人胃低分化腺癌细胞BGC82 3,经连续切片免疫组织化学染色、原位杂交、侵袭实验、酶谱分析及形态定量分析方法 ,进行金属蛋白酶 (MMP) 9、MMP 9mRNA、CD34、α SMA、VEGFR 1、VEGFR 2的检测 ,并结合临床病理参数进行综合分析。结果　MMP 9及其mRNA的表达均与癌组织的浸润深度、分化程度、淋巴结转移密切相关 ;MVD与癌组织的浸润深度、淋巴结转移关系密切 ;BGC82 3细胞MMP 9,MMP 9mRNA ,VEGFR 2染色均为阳性 ,VEGFR 1染色阴性 ;MMP 9抗体可使BGC82 3细胞侵袭细胞数由 6 9± 5个 /40 0倍下降为 (18± 4 )个 /40 0倍 ;直接培养于培养皿表面的BGC82 3细胞有稳定的MMP 9,MMP 2酶原表达 ,但培养于I型胶原包被培养皿表面的BGC82 3细胞MMP 2表达明显增强并出现活化形式 ;BGC82 3细胞与VEGF共孵育 ,条件培养基中MMP 9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加。结论　胃癌细胞自身具有产生与分泌MMP 9的能力 ,MMP 9对肿瘤的浸润、转移及间质血管新生具有促进作用。     

RAD001对胃癌MKN-45细胞生长影响的实验研究

目的探讨RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响及可能作用机制。方法体外培养MKN-45细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数检测MKN-45细胞数目,流式细胞术检测细胞周期分布,Western-blot检测核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶（p70S6K）、真核起始因子4E（eIF-4E）结合蛋白1（4E-BP1）、S6蛋白表达及磷酸化情况。结果RAD001作用于MKN-45细胞24 h：RAD001对MKN-45细胞的生长产生抑制作用,抑制作用具有时间依赖性;MKN-45细胞细胞周期发生改变,停滞在G0-G1期细胞比例增加;MKN-45细胞的4E-BP1、p70S6K、S6无明显变化,phosphate-p70S6K、phosphate-S6表达缺失,phosphate 4E-BP1表达下降。结论RAD001是通过抑制mTOR下游通路阻断4E-BP1及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节细胞周期以发挥抑制MKN-45细胞生长的作用。     

Gli1基因在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞生物学特性的影响

目的：探讨胶质瘤相关癌基因1（Gli1）在胃癌组织中的表达,阐明Gli1基因对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：收集95例胃癌患者胃癌组织和癌旁组织,RT-qPCR法检测胃癌组织和癌旁组织中Gli1mRNA表达水平,免疫组织化学法检测胃癌组织和癌旁组织中Gli1蛋白表达水平。以人胃癌细胞株MKN28、BGC823和SGC7901为研究对象,胃永生化上皮细胞株GES-1作为对照,RT-qPCR法检测各细胞株中Gli1mRNA表达水平。将Gli1-siRNA转染BGC823细胞后,实验分为对照组、con-siRNA组和Gli1-siRNA组;RT-qPCR法检测各组细胞中Gli1mRNA表达水平,CCK-8检测细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞迁移能力,Western blotting法检测各组细胞P27、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表达水平。结果：胃癌组织中Gli1mRNA表达水平和蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织（t=27.606,P<0.01;χ²=54.782,P<0.01）。在GES-1、MKN28、SGC7901和BGC823细胞中Gli1mRNA表达水平比较差异有统计学意义（F=86.341,P<0.01）。Gli1-siRNA组Gli1mRNA表达水平明显低于对照组和con-siRNA组（F=48.322,P<0.01）。Gli1-siRNA组胃癌细胞增殖率明显低于对照组和con-siRNA组（F=54.428,P<0.01）。Gli1-siRNA组胃癌细胞的迁移数低于对照组和con-siRNA组（F=257.788,P<0.01）。与对照组比较,con-siRNA组细胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）;与con-siRNA组比较,Gli1-siRNA组细胞中P27蛋白表达水平明显升高（t=-3.776,P=0.020）,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低（t=3.479,P=0.025;t=5.487,P=0.005）。结论：Gli1在胃癌组织表达水平高于癌旁组织,抑制Gli1基因的表达能抑制胃癌细胞增殖和迁移能力。