姜黄素对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨姜黄素对肝癌细胞（QGY）细胞增殖和细胞周期的调控及细胞凋亡的影响。方法 采用MTT法测定姜黄素在不同浓度，不同时间对QGY的抑制作用，流式细胞仪分析细胞周期分布，透射电镜观察细胞的超微结构变化。结果 姜黄素可抑制QGY的抑制作用。流式细胞仪分析细胞周期分布，透射电镜观察细胞的超微结构变化。结果 姜黄素可抑制QGY细胞的生长，其抑瘤率与药物浓度和作用时间呈依赖关系，72h的中效浓度（IC50）为49.50μmol/L，流式细胞仪分析证实姜黄素能使QGY细胞聚积在S期，电镜观察发现姜黄素可导致细胞变性。坏死，诱导细胞凋亡。结论 姜黄素可干扰QGY细胞的周期分布，具有细胞毒作用。抗增殖，诱导细胞凋亡的作用。     

钙释放激活钙通道调节分子1促进结肠癌细胞系SW480的增殖

目的 探讨钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)对结肠癌细胞系SW480增殖的影响及其机制.方法 以ORAI1干扰慢病毒感染SW480细胞,分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞中ORAI1mRNA和蛋白的表达,通过MTT法、集落形成实验和倍增时间检测细胞的增殖,流式细胞仪检测其周期,激光共聚焦显微镜检测细胞钙内流(SOCE),Western blot法检测细胞中ERK1/2、p-ERK1/2和CyclinD1蛋白表达.结果 SW480转染ORAI1干扰慢病毒72 h后,可见明显的荧光表达;干扰组较空病毒组和对照组,ORAI1的表达降低(P＜0.01)、细胞生长减慢(P＜0.05)、集落形成能力减弱(P＜0.01)、倍增时间延长(P＜0.01)、G1期细胞比例增高(P＜0.05)、SOCE内流峰值降低(P＜0.05)、p-ERK1/2和CyclinD1的蛋白表达量降低(P＜0.01).结论 ORAI1可能通过SOCE调节胞内Ca2+浓度,并进一步通过MAPK信号通路促进SW480细胞的增殖.     

ECV304-SKOV3和L929-H22细胞协同形成血管样结构的体外研究

目的:在建立肿瘤基质血管内皮细胞模型(ECV304-SKOV3)和成纤维细胞模型(L929-H22)的基础上,进一步探讨二者在肿瘤新生血管形成中的协同作用.方法:对ECV304-SKOV3和L929-H22细胞用RT-PCR测定其端粒酶活性,双室联合培养测定ECV304-SKOV3细胞游走与管腔形成能力、L929-H22细胞促进肿瘤细胞侵袭与内皮细胞管腔形成能力.结果:ECV304-SKOV3细胞和L929-H22细胞的端粒酶活性明显强于亲代细胞ECV304、L929,分别为0.778±0.011、0.875±0.026、0.692±0.014、0.684±0.012(P＜0.001).ECV304-SKOV3细胞较ECV304细胞的游走能力强2.10倍,差异非常显著(P＜0.001),且管腔形成能力明显增强,管腔数多0.94倍(P＜0.01),管腔长0.91倍(P＜0.01).L929-H22明显促进肿瘤细胞侵袭(P＜0.001)与ECV304、ECV304-SKOV3细胞形成管型(P＜0.05),尤其与ECV304-SKOV3联合培养时形成的管腔最多且最长(P＜0.01;P＜0.001).结论:肿瘤基质血管内皮细胞存活能力、游走与管腔形成能力增强.肿瘤基质成纤维细胞明显促进肿瘤细胞侵袭与血管内皮细胞形成管型.二者在肿瘤新生血管形成中有协同作用.     

姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3的抗增殖作用

目的:探讨姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制增殖作用及其机制.方法:采用MTT法测定姜黄素在不同浓度、不同时间对SKOV3的抑制增殖效应,流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率,透射电镜观察细胞的超微结构变化,免疫细胞化学法检测凋亡相关基因蛋白的表达.结果:姜黄素可抑制SKOV3细胞的生长,其抑制率与药物浓度和作用时间呈依赖关系,72h的中效浓度(IC50)为79.96μmol/L,流式细胞仪分析证实姜黄素能使SKOV3细胞聚积在G2/M,电镜观察发现姜黄素可诱导细胞凋亡,姜黄素作用72h后,免疫细胞化学表明突变型P53蛋白(MTP53)及Bcl-2表达减弱,Bax及Fas表达增强.结论:姜黄素对SKOV3细胞有抑制增殖作用,通过下调MTP53、Bcl-2的表达及上调Bax、Fas的表达而诱导细胞凋亡.     

大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件

背景:间充质干细胞适合生长、堵养的条件尚不十分明确,目前对于间充质干细胞的分离纯化以及体外培养亦没有统一的方法,而培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是进行以上实验的重要前提.目的:寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.设计、时间及地点:分组对比观察.实验于2007-04/09在重庆医科大学附属第一医院实验中心完成.材料;6～8 周龄雄性Wistar大鼠1只,体质量120 g,用于间充质干细胞的分离及培养.方法:采用仝骨髓培养法获取间充质干细胞,按不同接种密度(1×106,5×105,1×105,5×104,1×104 cm2)、血清体积分数(体积分数5%,10%,15%的胎牛血清)、首次换液时间(接种后6,12,24,48,72 h)及pH值(分别为7.0～7.1,7.1～7.2,7.2～7.3,7.3～7.4,7.4～7.5)分组接种,10 d后进行活细胞计数.主要观察指标:不同培养条件对间充质干细胞生长的影响;倒置显微镜下观察原代及传代间充质干细胞的形态变化;采用四甲基偶氮唑盐法绘制细胞的生长曲线,并计算细胞倍增时间;常规SABC免疫组织化学法检测传代间充质干细胞CD44、CD34的表达;流式细胞仪检测传代间充质干细胞生长周期.结果:①以1×106,5×105cm2密度接种的细胞数较多,余3种接种密度获得细胞数明显低于上述2种密度(P＜0.05).首次换液时间为48 h获得的细胞数量最多,各组间相比,差异有显著性意义(P＜0.05).体积分数5%血清组较体积分数10%、15%血清组细胞数量少(P＜0.05).pH值为7.1～7.2,7.2～7.3的培养液细胞生长活跃,细胞数量多,以pH值为7.0～7.1和pH 7.4～7.5培养的细胞生长缓慢,数量较少.②刚接种的间充质干细胞呈圆形,培养6～8 h后开始贴壁,呈纺锤状或类圆形;约10 d左右细胞基本汇合长满瓶底;传代后,细胞形态以梭形为主;经过一二次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致.③传代一二天细胞生长缓慢,生长停滞期:自3 d起,细胞生长进入对数生长期,四五天达到高峰:之后进入平台期,细胞倍增时间约为39.5 h.④传代间充质干细胞存在CD44抗原表达,而CD34呈阴性表达.⑤传代后82.93%的间充质干细胞处于G0/G1期,G2+M+S期细胞占17.07%.结论:细胞较佳接种密度为5×105cm2,合适血清体积分数为10%,首次换液时间为48 h,pH值为7.2左右;在适宜的培养条件下,间充质干细胞在体外生长状态良好,增殖速度快.     

微血管内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化及其移植的可行性

背景:骨髓间充质干细胞通过再生心肌细胞在心肌损伤性疾病治疗方面突显较大潜力,但目前仍未找到一种理想的诱导方式.目的:探讨微血管内皮细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的潜能,并分析其移植的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内移植实验,于2008-07/2009-02在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:清洁级二三月龄健康雄性SD大鼠16只,购自重庆医科大学实验动物中心方法:孔径0.4 μm的transwell小室,置入培养板孔构成双室培养体系.取SD大鼠1只,Ficoll密度梯度+贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,组织块法分离培养微血管内皮细胞.培养瓶中融合至50%生长良好的微血管内皮细胞,每3 d更换培养液,收集更换液过滤即制成条件培养液.体外实验分为4组:直接接触组、双室培养组、条件培养液组、培养液对照组,观察各种培养条件对骨髓间充质干细胞的心肌诱导效应.取SD大鼠15只建立心肌梗死模型,冠状动脉结扎后第6天任取1只大鼠明确心肌梗死建模是否成功,其余大鼠随机分为细胞移植组8只、模型对照组6只.造模1周后,细胞移植组将在双室模型中与微血管内皮细胞共培养5 d的骨髓间充质干细胞调整浓度为109L-1通过鼠尾静脉缓慢注入1 mL,模型对照组予等量DMEM,观察4周.主要观察指标:体外实验通过免疫荧光染色检测心肌标志物Tnl、α-actin的表达;采用心电图、荧光镜检、苏木精-伊红染色等方式评价体内移植的安全性及可行性.结果:直接接触组、双室培养组、条件培养液组部分骨髓间充质干细胞心肌标志物Tnl、α-actin阳性表达,荧光镜下胞浆发绿光(或红光),前2组诱导率基本相似(P>0.05),且均明显高于条件培养液组(P<0.05);培养液对照组细胞未向心肌样细胞分化.细胞移植后两组大鼠均存活良好,未出现死亡及恶性心律失常,4周后细胞移植组心脏冰冻切片荧光镜检显示心肌内有少量胞核蓝染的细胞,提示干细胞成功归巢,结合苏木精-伊红染色,归巢细胞位于心肌梗死灶周边区域,呈单个或小团聚集;而模型对照组心肌切片未见胞核蓝染的细胞.结论:微血管内皮细胞能够通过旁分泌途径诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,经微血管内皮细胞预处理过的骨髓间充质干细胞移植入大鼠体内是安全的,可成功归巢到大鼠心肌梗死灶及周边区.     

P38MAPK信号转导通路在大蒜素诱导THP-1细胞凋亡中的作用

目的:探讨大蒜素诱导THP-1细胞凋亡中P38MAPK及Fas基因表达的变化.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度大蒜素对THP-1细胞增殖抑制率;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测凋亡率的变化;免疫细胞化学法观察大蒜素处理后细胞内磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)表达及分布变化;Western blot检测大蒜素处理前后细胞内P-p38MAPK和Fas蛋白表达量的变化.结果:MTT显示大蒜素能抑制THP-1细胞增殖,并呈时间-剂量依赖性.其72h中效浓度(IC_(50))为12.8 mg·L~(-1).Annexin V-FITC/PI检测凋亡率随大蒜素浓度增加而增加.免疫细胞化学法检测药物处理后P-p38MAPK表达增加,主要分布于细胞核与细胞浆,而阴性对照组仅弱表达.Western blot结果分析P-p38MAPK,Fas蛋白表达量随大蒜素浓度的增加而增加,呈剂量依赖性.其阴性组、72 h的1/2 IC_(50)组、IC_(50)组P-p38MAPK蛋白表达水平(相对灰度值)分别为0.259 8±0.013 2,0.361 2±0.008 3,0.505 6±0.005 5;Fas蛋白表达水平分别为0.287 4±0.008 9,0.426 8±0.007 9和0.597 1±0.010 9,差别均有显著性意义(P<0.01).结论:大蒜素可诱导THP-1细胞凋亡,其诱导凋亡机制可能是通过激活P-p38MAPK/Fas途径实现.     

小鼠可移植性肝癌(H615)与骨髓瘤细胞(NSl)染色体核型分析

H615瘤细胞含有正常数量的染色体,其众数为40,G、C显带均未见其结构异常。NSI体外培养细胞株染色体众数为65,有二种标记染色体,即中部着丝点染色体及微小染色体。中部着丝点标记染色体在G、C显带时均能证实是由二条端部着丝点染色体融合而成     

柔红霉素长春新碱体外对人急性髓系白血病细胞株的相互作用

目的：观察柔红霉素、长春新碱联合应用在体外对人急性髓系白血病细胞株（HL－60）的相互作用。方法：采用MTT法，利用中效原理判断联合用药的效果。结果；两种药物单用及联合应用时随着药物剂量增加，其效应也增加。两药大剂量合用时为拮抗效应，较小剂量合用时为协同效应。两药合用时（除最小剂量外）与先用柔红霉素24小时或先用长春新碱24小时比较P＜0．01；小剂量合用时先用柔红霉素24小时与先用长春新碱24小时比较P＞0．05。两药合用时浓度变化会影响合用效应。结论：柔红霉素与长春新碱合用时大剂量为拮抗，较小剂量为协同；合用效应大小与两种药物浓度比例有关；与给药先后次序无关，同时给药效果好。