反义乙型肝炎病毒S基因T载体克隆的构建

目的:构建含部分乙型肝炎病毒(HBV)S基因反义序列的基因克隆.方法:根据GenBank中HBV S基因序列和计算机软件mCLONE分析的结果,设计S基因2侧引物,直接扩增出适合长度的反义HBV S基因,与PMD18T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:获得226 bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆经PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段的反向序列与GenBank中该基因的序列同源性为97%.结论:成功构建了含反义HBV S基因部分序列的T载体克隆.     

乙型肝炎病毒S与GM-CSF融合基因在HepG2细胞中的表达

目的研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎DNA疫苗的免疫增强作用。方法采用PCR方法,扩增乙型肝炎S基因约680bp的片段和GM—CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过基因定向克隆技术,构建融合基因真核表达质粒pcDNA3．1-S-GM-CSF,并在HepG2细胞中表达。结果经酶切、PCR及DNA测序鉴定,融合基因表达质粒pcDNA3．1-S-GM-CSF成功构建。将其转染HepG2细胞后,RT-PCR检测目的基因的转录,表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-GM-CSF单克隆抗体(mAbs)均产生特异性反应。结论融合基因表达载体pcDNA3．1-s-GM-CSF的成功构建并表达,为进一步研究乙型肝炎融合基因疫苗奠定了一定实验基础。     

HBV大分子表面蛋白基因真核重组载体的构建与鉴定

目的构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)大分子表面蛋白基因的重组载体，以便进一步研究其基因免疫以及对宿主细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38等信号传导通路的影响。方法设计合成2对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板，采用PCR法分别扩增HBV大分子表面蛋白基因(preS1／S2／S基因)片段；用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，连接到质粒pcDNA3．1( )相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了HBV大分子表面蛋白基因的重组载体。     

HBV S基因、PreS2/S基因真核重组载体的构建与鉴定

[目的]构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)S基因与PreS2／S基因的重组载体。[方法]设计合成2对寡核苷酸引 物,以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板,采用PCR法分别扩增HBV S基因、PreS2／S基因片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶 切后,分别连接到质粒pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。 [结果]酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。[结论]成功构建了S基因与 PreS2／S基因的重组载体。     

乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的为研究HBVX基因（HBx）与原发性肝细胞癌发生的关系，克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法从HepG2．2．15细胞中扩增出HBx的cDNA，克隆到质粒PCDNA3．1中。结果RT—PCR扩增出约460bp片段，经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体（HBx—PCDNA3．1）构建成功，测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx—PCDNA3．1。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的 应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段，并进行克隆、测序分析，制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法 利用Olig06．4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物，纯化PCR扩增产物，扩增后的产物克隆至pMDl8-T载体并进行快速鉴定，提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果 获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明，所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论 利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒,获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析．方法：PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因,双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a,转化E．coli DH5α,酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序;然后转化E．coli B121,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni^2＋ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白,Westem Blot分析特异性和抗原性．结果：成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2＋ -NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性．结论：HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化,为研究新型乙肝疫苗奠定了基础．     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因表达及鉴定

目的　乙型肝炎病毒核糖核酸酶 H (HBV- RNase H)为该病毒生活周期中负链 DNA合成所必需 ,获取该基因片段及其表达蛋白 ,为进一步的基础研究及应用研究创造条件 .方法　以 HBV全基因片段为模板 ,PCR方法定位扩增 HBV-RNase H特异性片段 ,连接于 p T7Blue克隆载体 ,酶切鉴定并测序后克隆于 p GSTag载体进行原核表达 .PAGE电泳及Western杂交鉴定表达产物 .结果　DNA测序结果显示 PCR扩增产物及载体中插入片段与已知序列相同 ;Western杂交结果表明 ,所表达产物为 GST与 RNase H的融合蛋白 .结论　 HBV- RNase H基因的成功克隆及表达为进一步研究 HBV感染的早期诊断及乙肝患者的治疗奠定了基础     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段,并进行克隆、测序分析,制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法利用Oligo6.4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物,纯化PCR扩增产物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定,提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明,所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT—PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcDNA3．1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了。mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的 构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA.结论 成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础.     

HBV S基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答

目的 观察小鼠对IL-12基因表达质粒与HBVS基因疫苗联合免疫的免疫应答。方法 用已构建的HBVS基因疫苗（pCR3.1-S)和表达IL-12p35和p40蛋白的真核表达载体pWRG3169分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法检测小鼠血清抗-HBs及脾细胞对HBsAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2wk后小鼠血甭抗-HBs滴度及脾细胞对HBsAg的刺激指数均明显高于对照组,pWRG3169 pCR3.1-S组明显高于单纯pCR3.1-S注射组。结论 IL-12表达质粒可以增强pCR3.1-S基因疫苗诱导的体液和细胞免疫应答强度,尤以细胞免疫增高明显。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与乙型肝炎病毒（HBV）preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法 ,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光,PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达,为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。     

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的构建人血管内皮生长因子(VEGF-C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF-C的生物学功能奠定基础.方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF-C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中.采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达.结论经RT-PCR扩增转染细胞cDNA和Western blotting检测证实重组质粒pcDNA3.1-VEGF-C能在宿主细胞中高效表达.     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.