共表达双基因Adv CD40L-IRES2-ICOSL对小鼠乳腺癌的实验研究

目的探讨CD40L-IRES2-ICOSL腺病毒载体对小鼠乳腺癌模型的治疗作用。方法利用基因转染技术,分别构建腺病毒载体,建立小鼠乳腺癌动物模型,随机分为4组,2周后于瘤体内分别注射转染有空载体及不同的重组载体的乳腺癌细胞,观察组织病理改变、肿瘤体积、重量变化和荷瘤小鼠的生存时间。结果 CD40L组、ICOSL组、CD40L-IRES2-ICOSL组肿瘤内淋巴细胞浸润明显增多。与对照组相比,CD40L组、ICOSL组肿瘤生长减缓,体积减小,荷瘤生存期延长,两组间均有显著差异(P0.05),而CD40L-IRES2-ICOSL组尤为显著(P0.01);CD40L组与ICOSL组相比则无显著差异。结论共表达双基因Adv CD40L-IRES2-ICOSL治疗小鼠乳腺癌动物模型,能直接杀伤肿瘤,抑制肿瘤生长,延长荷瘤动物的生存期。     

腺病毒介导人IL-2基因治疗的抗肿瘤作用及机理分析

目的　观察重组人白介素 2腺病毒 (advh IL- 2 )在小鼠肝癌 H2 2中的转染效率、表达时程、体内抗肿瘤作用及其免疫机理。方法　小鼠皮下接种肝癌 H2 2 ,将肿瘤生长至体积为 10 0～ 2 0 0 mm3的荷瘤小鼠随机分组 ,经肿瘤局部注射给药。用 X- gal染色法检测重组腺病毒载体 adv L ac Z的转染效率 ;用 RT- PCR检测人 IL- 2基因的持续表达时间 ;以 H2 2瘤体生长及荷瘤小鼠存活时间评价 advh IL - 2抗肿瘤作用 ;以 51 Cr 4小时释放法测定治疗小鼠脾细胞的 L AK与 CTL 杀伤活性 ,免疫荧光法分析肿瘤组织内 CD4 +与 CD8+ T细胞浸润情况。结果　肿瘤局部单次注射 1× 10 9pfu重组腺病毒 ,可在肿瘤组织中进行有效的转染及表达 ,人 IL- 2基因的表达时间长于 12 d。AdvhIL- 2的抗肿瘤作用具有剂量依赖性 ,与 PBS组比较 ,2× 10 9pfu advh IL- 2可非常明显地抑制 H2 2皮下瘤的生长、延长荷瘤小鼠的生存时间 (P<0 .0 1) ,同时明显增强脾细胞 L AK与 CTL杀伤活性 (P<0 .0 1) ,增加肿瘤组织内CD4 + 与 CD8+ T细胞的浸润。结论　 Advh IL - 2通过介导人 IL - 2基因在小鼠 H 2 2肿瘤组织中的持续表达 ,产生明显的体内抗肿瘤作用 ,其机理与激活荷瘤小鼠抗肿瘤免疫反应有关     

瘤体注射IL-2重组腺病毒基因治疗小鼠胶质母细胞瘤及其免疫机制的初步探讨

目的：观察瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对G422皮下荷瘤的治疗作用,对体内基因转染效率及治疗的免疫机制进行初步分析。方法：将LacZ,IL-2重组腺病毒直接注射到皮下接种的G422胶质母细胞瘤瘤体,X－gal染色检测基因转染的效率,观察肿瘤的大小和荷瘤小鼠的存活期,采用4h^51Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的NK、LAK、CTL的杀伤活性,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果：采用瘤体注射腺病毒具有较高的体内基因转染效率,瘤体注射IL－2重组腺病毒对皮下建立的胶质母细胞瘤有一定的治疗作用,肿瘤的生长受抑制,荷瘤小鼠的存活期显延长,但没有长期存活小鼠。IL－2基因治疗组小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性显增强,肿瘤局部出现更多的坏死和炎性浸润细胞。结论：采用瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对胶质母细胞瘤皮下荷瘤有治疗,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。     

复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的作用研究

目的观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用,及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用,并对其机制进行探讨。方法利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞）中。结果①携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达;②将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达;③将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠,其体内致瘤性明显降低,且对野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用;④瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。该结果提示,利用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP的构建及鉴定

目的 构建特异性强,转染率高,针对人Survivin进行RNA干扰的肿瘤增殖型腺病毒载体(Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP). 方法将针对人Survivin的shRNA的基因序列及EGFP基因序列克隆至肿瘤增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD;HEK-293细胞中包装出毒得到重组腺病毒Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP并测序鉴定.用重组腺病毒感染结肠癌细胞HT-29并检测转染率,用RT-PCR和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化. 结果序列测定证明针对人Survivin的shRNA序列及EGFP序列被成功构建到肿瘤增殖型腺病毒载体中;Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP对结肠癌细胞HT-29的转染效率显著高于增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P＜0.01);而对肝细胞的转染率则显著低于对结肠癌细胞株HT-29的转染(P＜0.01).与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较,转染Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低(P＜0.01).结论 构建成功携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒载体Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP,其能选择性地高效转染结肠癌细胞株HT-29并有效干扰Survivin,且较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率.     

Sensitization of prostate cancer cell lines to 5-fluorocytosine induced by adenoviral vector carrying a CD transcription unit

目的　研究胞嘧啶脱氨酶 /5-氟胞嘧啶系统对前列腺癌细胞株的作用。方法　细胞培养 ,细胞转染 ,药物敏感性实验 ,观察旁观者效应 ,动物实验。结果　腺病毒载体可以转染所有已建立的前列腺癌细胞株 ,但是每种细胞株转染所要求的载体浓度以及暴露时间不同。转染的胞嘧啶脱氨酶基因在细胞内的表达高峰出现在不同的时间 ,但一直持续到 11天以后。腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶基因转染可以使前列腺癌细胞株提高对 5-氟胞嘧啶的敏感性。在LNCap和RM - 1细胞株中 ,只有 5%的细胞转染了胞嘧啶脱氨酶基因就可以引起 10 0 %的细胞杀伤效应。在动物实验中 ,用 40 0MOI转染过的肿瘤细胞建立小鼠皮下肿瘤并同时腹腔注射 5-氟胞嘧啶 ,可以有效的抑制肿瘤生长。结论　腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶基因转染可以提高前列腺癌细胞株对 5-氟胞嘧啶的敏感性 ,胞嘧啶脱氨酶 /5-氟胞嘧啶的联合应用能显著抑制小鼠肿瘤生长。     

重组人5型腺病毒对B16黑色素瘤生长的抑制作用

目的 研究瘤内直接注射重组人5型腺病毒H101对B16黑色素瘤生长以及对手术后再次接种B16黑色素瘤细胞后肿瘤生长的影响.方法 建立小鼠B16黑色素瘤动物模型.瘤内直接注射H101腺病毒,测量肿瘤体积,切除肿瘤,再次接种B16黑色素瘤细胞,观察肿瘤生长情况.结果 细胞接种8 d后,全部小鼠均长出肿瘤.H101注射组肿瘤的体积在给药后3,6,9 d,都显著小于对照组.再次接种B16黑色素瘤细胞后,H101注射组肿瘤的生长速度也显著小于对照组.结论 瘤内直接注射H101对B16黑色素瘤生长具有抑制作用,对手术后再次接种的肿瘤生长也具有抑制作用.     

异种抗原免疫序贯瘤内注射对肿瘤浸润淋巴细胞的影响

目的 研究异种抗原免疫序贯瘤内注射对瘤荷小鼠的治疗作用,以及该方法 对肿瘤浸润淋巴细胞的影响.方法 使用异种抗原免疫序贯瘤内注射的方法 处理小鼠,观察肿瘤的大小,分离肿瘤浸润淋巴细胞,并利用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及各细胞亚群的比例.结果 各组小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+ T细胞数量差异无显著性.免疫后治疗组中的CD3+ CD4+ T细胞、CD3+CD8+ T细胞以及CD3+ CD4+ CD25+ T细胞所占比例分别为54%、22%和2.91%,其中CD4+ 与CD8+ 的比值为2.49,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01).结论 异种抗原序贯瘤内注射方法 可以增加肿瘤微环境中效应细胞的数量,减少CD3+ CD4+ CD25+ T调节细胞的表达,具有显著的抗肿瘤效应.     

NIH3T3细胞及小鼠骨骼肌中人PH-20基因疫苗的表达

目的:研究人PH-20基因疫苗在体内外的表达.方法:以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )-hPH-20基因疫苗导入MH3T3细胞中,RT-PCR和原位杂交检测hPH-20 mRNA的表达.以脂质体介导基因转染法将疫苗接种于BALB/C小鼠后腿股内侧肌,分别于接种后第4、7、11、16天取小鼠股内侧肌进行RT-PCR检测.结果:体外转染的NIH3T3细胞阳性克隆经RT-PCR检测,可见1530 bp目的条带;原位杂交结果显示阳性细胞胞浆中可见蓝紫色颗粒.取注射基因疫苗后的小鼠注射部位肌肉以RT-PCR法检测到1 530 bp的目的条带,空载体及生理盐水对照组未见目的条带.结论:人PH-20基因疫苗体内外均可表达.     

异种抗原免疫续贯瘤内注射对肿瘤浸泣淋巴细胞的影响

目的 研究异种抗原免疫续贯瘤内注射对瘤荷小鼠的治疗作用,以及该方法对肿瘤浸润淋巴细胞的影响。方法 使用异种抗原免疫续贯瘤内注射的方法处理小鼠,观察肿瘤的大小,分离肿瘤浸润淋巴细胞,并利用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及各细胞亚群的比例。结果 各组小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+T细胞数量没有统计学差异。免疫后治疗组中的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞以及CD3+CD4+CD25+T细胞所占比例分别为54%、22%和2.91%,其中CD4+与CD8+的比值为2.49,这与对照组之间存在显著性差异（P < 0.01）。结论 异种抗原续贯瘤内注射方法可以增加肿瘤微环境中效应细胞的数量,减少CD3+CD4+CD25+T调节细胞的表达,具有显著的抗肿瘤效应。 【关键词】异种抗原 免疫治疗 肿瘤浸润淋巴细胞     

脂质体介导的骨骼肌细胞的基因转移

采用２种阳离子脂质体──ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ和ｌｉｐｏｆｅｃｔａＭＩＮＥ作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。骨骼肌细胞为取自新生ＳＤ大鼠骨骼肌经２ｄ培养的原代细胞，外源性基因来自质粒ｐＲＳＶＬａｃＺ中的报告基因──β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因。结果证明用此２种阳离子脂质体可使ＬａｃＺ基因在培养骨骼肌细胞中表达率达到２０％。这说明应用阳离子脂质体在真核细胞中实施转基因是一种有效方法。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

ZBTB20基因干扰腺病毒的制备及功能鉴定

目的 制备靶向锌指蛋白ZBTB20基因的干扰腺病毒。方法 根据ZBTB20基因序列设计人鼠通用的干扰序列，定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-U6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ位点。PmeⅠ酶切线性化的重组穿梭载体pShuttle-shZBTB20导入含有腺病毒载体pAdEasy-1的细菌，使同源重组产生重组腺病毒载体pAd-shZBTB20。用PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体，转染293A细胞以包装腺病毒颗粒，用TCID50法鉴定病毒滴度，并在人肝癌Huh7细胞和小鼠肝脏组织中验证该病毒的干扰效率。结果 成功构建了人鼠通用的ZBTB20基因干扰腺病毒载体，获得高活性的ZBTB20干扰腺病毒Ad-shZBTB20，滴度为3.2x1010 IU/ml。该干扰腺病毒感染人肝癌细胞株96 h可使ZBTB20 mRNA降低至对照的20%；尾静脉注射7天后可显著下调肝脏内源性ZBTB20蛋白的表达，并使其靶基因甲胎蛋白mRNA表达水平升高200倍以上。结论 所制备的ZBTB20干扰腺病毒能有效抑制人和小鼠ZBTB20的蛋白表达及其生物学效应，为ZBTB20功能研究和干预应用提供技术手段。     

应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒

目的 构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法 应用PCR扩增出CD和TK基因，经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK。经酶切线性化后。转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。滴度测定后，体外感染血管内皮细胞ECV304。结果 PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒，为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短。     

腺病毒介导蜂毒素基因转染对HepG2细胞生长及AFP表达的影响

目的:将蜂毒素基因置于甲胎蛋白(AFP)转录调控元件(rAFP)驱动之下,构件重组腺病毒载体,观察蜂毒素基因转染对肝癌细胞生长及AFP表达的影响.方法::将蜂毒素基因置于rAFP之后,用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中,将腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,用脂质体介导转染293细胞进行腺病毒的包装.携有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌细胞后,RT-PCR实验观察蜂毒素基因是否发生转录;MTT法测定蜂毒素基因转染对肝癌细胞增殖的影响;ELISA双抗体夹心法定量检测AFP.结果:RT-PCR实验表明蜂毒素基因转染肝癌细胞后可以被转录;蜂毒素基因在rAFP的控制下,可以特异性的抑制AFP阳性肝癌细胞的增殖,并降低其AFP的生成量.结论:蜂毒素基因转染对肝癌细胞的生长及AFP的表达具有抑制作用,可降低其恶性度.     

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立(英文)

目的建立人乳头状瘤病毒（HPv）16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，确证HPv与喉癌的发生有无关系。方法采用脂质体介导法，将pSVHPV16DNA导入原代培养的人喉上皮细胞，继续培养、传代，取20代细胞，用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段，用免疫组化染色检测E6、E7蛋白的表达，用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性。结果有3株细胞已连续培养传代超过20代，细胞含有HPV16DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达，细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长，生长曲线呈典型的“s”型，细胞增殖指数为48％，所有细胞均表达角蛋白，胞浆含张力原纤维，软琼脂培养克隆形成试验阴性。结论成功建立了HPV16DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，为喉癌研究提供了新的理想模型，HPV16对人喉上皮有致癌作用，在喉癌组织标本中检测到的HPV16DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用。     

应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒

目的 改进AdEasy系统，使之更简便、高效、快捷。方法 pAdtrack经酶切线性化后，转化经氯化钙处理的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。荧光显微镜下细胞中重组腺病毒观察绿色荧光蛋白的表达。结果 应用氯化钙法由pAdtrack转化AdEasier-1细菌，可获得极高比例的(20／20)阳性重组腺病毒克隆。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短、对实验室的条件要求低。     

LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

NF-κB“诱骗”寡核苷酸对LPS诱导的SW480细胞IL-1β表达的影响

目的探讨核转录因子-κB（NF-κB）＂诱骗（decoy）＂寡核苷酸（ODNs）对脂多糖（LPS）诱导的结肠癌SW480细胞IL-1β表达的影响。方法体外培养SW480细胞并随机分为5组,对照组、LPS组（以10μg/L的LPS刺激3h）、NODN组（以10μg/L的LPS刺激3h后转染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs）、SODN组（以10μg/L的LPS刺激3h后转染1μmol/L的错译ODNs）、lipofectin2000组（以10μg/L的LPS刺激3h后加入同剂量的lipofectin2000）,检测各组细胞培养液中LDH的水平,并应用RT-PCR技术检测各组细胞IL-113 RNA的表达。结果各组细胞培养液中LDH浓度差异无统计学意义（P〉0.05）。与对照组比较,LPS组、NODN组、SODN组及lipofectin2000组IL-1 13 mRNA表达均升高,差异有统计学意义（P〈0.01）;与LPS组比较,NODN组IL-1βmRNA表达显著降低（P〈0.01）,而SODN组及lipofectin2000组差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 NF-κB decoy ODNs可有效下调SW480细胞IL-1βmRNA的表达,有望成为治疗炎性肠病的一种新型基因药品。