亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。 方法：以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号（NSL）加入PTEN序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定。结果：重组质粒PUM-PTEN酶切在1　200　bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1　200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1　200 bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列。结论：成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN。     

HBV大分子表面蛋白基因真核重组载体的构建与鉴定

目的构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)大分子表面蛋白基因的重组载体，以便进一步研究其基因免疫以及对宿主细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38等信号传导通路的影响。方法设计合成2对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板，采用PCR法分别扩增HBV大分子表面蛋白基因(preS1／S2／S基因)片段；用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，连接到质粒pcDNA3．1( )相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了HBV大分子表面蛋白基因的重组载体。     

肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定

目的 构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体.方法 以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ酶切位点的HBx基因片段.双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接.重组质粒转化到大肠杆菌DH5a后,经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体.结果 成功构建了重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体,经DNA序列测定与比对,重组前后HBx基因片段序列一致.结论 pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体构建成功,可为HBx基因缺失型突变体,特别是HBx-d382基因的生物学功能研究提供基因材料.     

人4—1BB—hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人4－1BB胞膜外区-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体。方法：PCR扩增人4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc基因片段，用HindⅢ、PstI酶切4－1BB胞膜外区，PstI、EcoR I酶切hIgG1Fc,HindⅢ、EcoRI酶切pCDNA3，纯化后的酶切产物经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，PCR及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对4－1BB胞膜外区和hIg1Fc的引物进行PCR扩增，电泳后观察到一558bp、708bp的特异性条带，与4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在pCDNA3质粒中的4－1BB和hIgG1Fc序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人4－1BB胞膜外区－hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体，为表达4－1BB融合蛋白奠定基础。     

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

目的：构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TS045-4B的真核表达质粒pcDNA3．1／TS045-4B。方法：全基因合成TSO45-4B的基因序列，并利用PCR扩增该基因序列，将其插入真核表达载体pcDNA3．1，经酶切、测序鉴定。结果：经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因。结论：成功构建pcDNA3．1／TS045-4B重组质粒。     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

人rgs4真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建人rgs4基因真核表达质粒。方法采用RT-PCR方法，扩增人rgs4基因片段，插入真核表达质粒pcDNA3．1中，转化大肠杆菌DH5a，通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和测序验证阳性重组克隆。结果RT—PCR自人胚肾上皮细胞（HEK293）中扩增出目的基因片段，插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致，测序结果证明为人rgs4基因。结论成功构建了人rgs4编码框全长的真核细胞表达质粒。     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fim H基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌临床分离株Ⅰ型菌毛编码基因fimH 为目的基因的真核表达载体pcDNA3.0-fimH.方法 提取尿路致病性大肠杆菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR 、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒.通过PCR 、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定.结果 PCR 法克隆出全长为903 bp 的fimH基因并构建了pcDNA3.0-fimH重组质粒.结论 本研究成功构建尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3.0-fimH,为尿路致病性大肠杆菌基因疫苗的研制奠定了基础.     

从妊娠人胎盘绒毛组织克隆HLA—G1 cDNA

为系统研究HLA－G1人子的生物学功能，采用RT－PCR技术，从人流的胎盘绒毛组织中提取总PNA，经过逆转录合成HLA－G1的全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3中，构建重组表达质粒pcDNA3-HLA-G1，转化大肠杆菌DH5a，筛选其阳性克隆株，经酶切，PCR及测序鉴定，证实HLA－G1分子的重组真核表达载体已构建成功。     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

凝血栓蛋白—1 I型重复序列真核表达载体的构建

目的：构建凝血栓蛋白－1 I型重复序列真核表达载体。方法：采用RT－PCR技术，从人胎儿肺组织中扩增凝血栓蛋白－1I型重复序列基因，通过连接反应构建重组克隆载体和和重组表达载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，双酶切鉴定及测序。结果：获得了预期的扩增产物－凝血栓蛋白－1 I型重复序列基因，测序结果经GenBank分析，一致性为99％.结论：成功构建了pcDNA3.1^ /TSP-1 I型重复序列真核表达载体。     

弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

从妊娠人胎盘绒毛组织克隆HLA-G1 cDNA

为系统研究HLA-G1分子的生物学功能,采用RT-PCR技术,从人流的胎盘绒毛组织中提取总RNA,经过逆转录合成HLA-G1的全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3中,构建重组表达质粒pcDNA3-HLA-G1;转化大肠杆菌DH5α,筛选其阳性克隆株,经酶切、PCR及测序鉴定,证实HLA-G1分子的重组真核表达载体已构建成功。     

人血栓调节蛋白基因真核表达质粒的构建

目的：构建人血栓调节蛋白(human thrombomodulin，hTM)基因的真核表达质粒，为研究hTM在抗血栓、抗炎症、抗血管增生等方面的作用及其临床应用奠定基础。方法：用PCR法扩增出hTMcDNA表达片段。把载体质粒pcDNA3．1( )／neo和hTM片段用EcoRⅠ HindⅢ双酶切，T4DNA连接酶进行连接。结果：重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α内扩增。提取、纯化后用HindⅢ、EcoRⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明hTMcDNA表达片段已被完整、正确的插入到pcDNA3．1( )／neo质粒中。结论：成功构建了hTM基因的真核表达质粒pcDNA-hTM。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

RPS27a蛋白重组质粒的构建及其在肝癌细胞株的定位

目的:构建pcDNA3.1-RPS27a重组质粒载体并观察其在HepG2和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况.方法:使用基因合成法合成RPS27a基因,将扩增后的目的基因连接至pcDNA3.1载体.转化DH5α大肠埃希菌后,进行质粒抽提然后电泳及测序鉴定.将鉴定后的pCDNA3.1-RPS27a质粒分别转染HepG2和SMMC7721细胞株,通过激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的表达和定位情况.结果:pCDNA3.1-RPS27a 重组质粒构建成功.通过激光共聚焦显微镜观察发现RPS27a主要表达于HepG2和SMMC7721细胞的胞质中.结论:pCDNA3.1-RPS27a载体构建成功,证实了RPS27a主要表达于HepG2和SMMC7721细胞的细胞质中.     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

以HBc颗粒为呈现载体的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel探索其作为DNA疫苗载体的可能性。方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc—core的HBcAg el—loop处添加Nhel酶切位点，双酶切此重组载体pTrc-core^Nhel及真核表达载体pcDNA3．1，产物经纯化、T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选抗Amp^＋克隆并提取质粒进行酶切及PCR鉴定。结果成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-HBc^Hhel。结论该重组质粒可作为治疗性及预防性疫苗的候选载体，为深入研究预防性及治疗性疫苗奠定了基础。     

SDF-1α基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建SDF-1α真核表达载体，为研究SDF-1α基因功能提供工具。方法：从大鼠平滑肌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增SDF-1α的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1上，并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果：PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pcDNA3．1／SDF-1α。通过对SDF-1α基因编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。结论：成功构建了SDF-1α真核表达载体，为SDF-1α基因功能研究奠定基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）X基因的真核表达载体，为探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系提供实验依据。方法用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对pcDNA3．1（＋）载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并对其进行双酶切和测序鉴定，构建HBVX基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx。用梭华-Sofast^TM基因转染试剂将其质粒转染THP-1巨噬细胞，细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后做Western blotting，鉴定目的蛋白。结果双酶切pcDNA3．1（＋）-HBx后，琼脂糖电泳可分别见到大小约为5．4kb和465bp片断，说明X亚克隆入pcDNA3．1（＋），经序列测定其含有完整的X基因片段；Western blotting结果显示pcDNA3．1（＋）-HBx能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx，并能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。