抗HPV16E7－ribozyme和靶RNA相互作用的计算机分析

应用计算机分析了抗ＨＰＶ１６Ｅ７－ｒｉｂｏｚｙｍｅ的体外切割反应结果，发现ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ的二级结构及其能量变化能影响ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性。根据锤头结构ｒｉｂｏｚｙｍｅ的能量变化模型，对抗ＨＰＶ１６Ｅ７－ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ在痘苗表达体系及稳定表达体系中的相互作用，进行计算机模拟分析。结果表明，计算机分析ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ在细胞内的相互作用，可以指导ｒｉｂｏｚｙｍｅ的设计和在体内的应用研究。     

抗HPV16E7－ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备抗ＨＰＶ１６Ｅ７－Ｒｚ的方法。切割实验表明，ｒｉｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７靶ＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物。体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ和ｋｃａｔ值与人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｒｉ－ｂｏｚｙｍｅ具有特异的催化切割活性。     

抗HPV16E7—ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备ＨＰＶ１６Ｅ７Ｒｚ的方法，切割实验表明，ｒｉｌｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７ａｆｃｎＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物，体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ的ｋｃａｔ值民人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｉｉｂｚｙｍｅ具有特殊的催化切割活性。     

角质形成细胞转染人乳头瘤病毒后c-jun、c-fos及MDM2基因的表达

目的 研究正常角质形成细胞转染人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６后，c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ表达情况。方法 在无血清的Ｍ１５４培养基上培养角质形成细胞，适当时进行传代培养。采用转染试剂ＦuＧＥＮＥ∧ＴＭ６将质粒pＳＶ２－neo/ＨＰＶ１６转入正常角质形成细胞，应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测转染后角质形成细胞中c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ表达。结果 转染质粒pＳＶ２－neo/ＨＰＶ１６后角质形成细胞形态的所改变，细胞变大，胞核结构疏松，胞浆出现颗粒。转染细胞株中，检测到ＨＰＶ１６mＲＮＡ的表达，扩增产物为１１０bp；同时检测到ＨＰＶ１６ＤＮＡ片断（７．９kb）。转染后角质形成细胞中有c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ的表达。结论 体外试验提示ＨＰＶ感染可能通过c－jun、c－fos、ＭＤＭ２的表达而促进细胞的增生。     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

抗HPV16E6核酶和抗HPV18E6核酶的设计与表达

以核酶的锤头结构为模型，采用计算机软件针对ＨＰＶ１６Ｒ６、ＨＰＶ１６Ｅ６基因，设计了相应的ｒｉｂｏｚｙｍｅ。体外合成ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因后，克隆于带自身修剪功能的原核质粒ＰＲＧ５２４中，构建成质粒ｐＲＧ１６ＨＲ、ｐＧＲ１８ＨＲ，为下一步研究抗１６ＨＲ，抗１８ＨＲ的体外活性效应，从而为探索以ｒｉｂｏｚｙｍｅ治疗ＨＰＶ相关性肿瘤的途径打下基础。     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ的锤头状核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ），并构建抗ｍｄｒｌ－ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶分子的体外转录质粒，进行体外切割实验。结果 发现抗ｍｄｒ１－ｒｉｂｏｚｙｍｅ能较好地切割ｍｄｒｌ－ｍＲＮＡ。结论 抗肿瘤多药性核酶的体外研究为基体内应用提供了参考，ｒｉｂｏｚｙｍｅ有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

HPV16L1—E7重组腺病毒rAd5HPV16L1—E7的构建及克隆表达

目的：研制人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１－Ｅ７重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以ＨＰＶ１６型－１１４／Ｋ为模板,利用ＰＣＲ克隆技术构建可表达ＨＰＶ１６主要宙蛋白Ｌ１（１－３０１ａａ）和转蛋白Ｅ７（１－６０ａａ）融合基因的重组质粒ｐＵＣ１９Ｌ１－ｐＨＢＧ１０共转染２９３细胞,制备重组腺病毒ｒＡｄ５ＨＰＶ１５６Ｌ１－Ｅ７,密度梯度超速离心纯楷ＨＰＶ     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１Ｅ７嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法扩增获得ＨＰＶ６ｂ　的　Ｌ１Ｅ７　嵌合基因片段，ＴＡ　克隆后，再将Ｌ１－Ｅ７　基因克隆入ｐＴＥＴｎｉｒ１５　沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌Ｓ．ＢＲＤ５０９（△ａｒｏＡ，△ａｒｏＣ）中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　凝胶电泳　和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析。结果：用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切重组表达质粒ｐＴＥＴｎｉｒ１５６ｂＬ１Ｅ７可释放２３８９ｂｐ和１５５４ｂｐ两片段，结果与预计相符。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，重组沙门菌在约５６ＫＤ处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７　融合蛋白，人乳头瘤病毒ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７重组减毒沙门菌构建成功。     

抗c—erbB—2 ribozyme的计算机设计

设计能特异性切割人癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２ｍＲＮＡ的核酶。概据Ｓｙｍｏｎｘ的“猛士锤头结构”,以人癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２ｍＲＮＡ为靶ＲＮＡ,用计算机对其可能为核酶切割的位点进行分析以寻找最佳切点。对底物及核酶的二级结构进行预测。     

特异性反义寡核苷酸对含HPV16的SiHa细胞的作用

研究特异性反义寡核甘酸对含ＨＰＶ１６的Ｓｉ－Ｈａ细胞的抑制作用。方法人工合成２条分别与ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７基因起始码互补的反义硫代磷酸化核甘酸及１条随机序列，用此３种反义寡核甘酸处理ＳｉＨａ细胞，观察其细胞成活率和细胞蛋白总量的改变。结论此ＡｎｔｉＥ６，ＡｎｔｉＥ７能有效地抑制含ＨＰＶ１６的ＳｉＨａ细胞的生长。     

反义寡核苷酸对HPV16阳性人宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨反义硫代寡核苷酸对ＨＰＶ１６阳性的人宫颈癌细胞增殖的影响，方法：人工合三段１８－ｍｅｒ的反义硫代寡核苷酸Ｓ－ＯＤＮ１－３，其中Ｓ－ＯＤＮ１（ＡＥ６），Ｓ－ＯＤＮ２（ＡＥ７）分别与ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因的起始码及其下游序列互补Ｓ－ＯＤＮ，为一随机序列，分别用三种反义寡核苷酸处理整合有ＨＰＶ１６基因组的人宫颈癌细胞ＳｉＨａ。通过四唑盐比色法，＾３Ｈ－ＴｄＲ参入试验观察不同浓度反义寡核苷酸对Ｓ     

输血后肝炎抗—HCV与HCV—RNA检测及临床意义

本文用套式聚合酶链反应及ＥＬＩＳＡ对６６例输血后不同时期发生的输血后肝炎进行了ＨＣＶ－ＲＮＡ及抗－ＨＣＶ的检测，４３例抗－ＨＣＶ阳性血清中，ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性３９例，２３例抗－ＨＣＶ阴性血清中，７例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性；按输血史时间长短分组测定结果表明，两项指标的消长情况不等，早期发病者中，以ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性为主，晚期发病者中以抗－ＨＣＶ为主。     

实验感染的猕猴血清和粪便中HEV RNA动态变化研究

应用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法检测实验感染ＨＥＶ猕猴急性期血清及粪便标本中ＨＥＶ ＲＮＡ，并与其血清ＡＬＴ异常和抗－ＨＥＶ ＩｇＧ阳转相比较，以了解猕猴感染ＨＥＶ后上述各项标志的动态变化规律。结果表明，ＨＥＶ ＲＮＡ血症多出现于ＡＬＴ升高之前，持续约１￣２周，当血清抗－ＨＥＶ ＩｇＧ阳转时ＨＥＶ ＲＮＡ即转为阴性；粪便ＨＥＶ ＲＮＡ可与病毒血症同时出现，但持续时间较病毒血症为长，于感染     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7基因在体内和体外的表达

构建人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７湖北株（ＨＢ）基因真核表达质粒,探讨其在哺乳动物体外,体内表达状况,为本地区ＨＰＶ相关肿瘤的基因治疗提供依据。方法采用分子克隆技术,构建ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ重组表达质粒,磷酸钙－ＤＮＡ沉淀技术及基因免疫技术将外源目的基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞及大、小鼠体内ＰＣＲ,ＲＴ－ＰＣＲ,免疫荧光染色技术对外源目的基因及其产物（ｍＲ－ＮＡ,蛋白质。     

子宫颈鳞癌 Rb 基因与 HPV16 E7 基因的相关性研究

用多聚酶链反应—单链构象多态性分析（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）以及地高辛标记探针斑点杂交技术对３０例子宫颈鳞癌组织中Ｒｂ抑癌基因及ＨＰＶ１６Ｅ７癌基因进行分析。结果３０例子宫颈鳞癌组织中未检出Ｒｂ基因突变或缺失；２０例癌组织中检出ＨＰＶ１６Ｅ７ＤＮＡ，阳性率为６７％。提示ＨＰＶ１６Ｅ７癌基因与子宫颈鳞癌密切相关。子宫颈鳞癌中Ｒｂ基因结构异常并不常见，而且与ＨＰＶ１６Ｅ７基因的存在状况无明显相关性。     

c—myc基因特异核酶的设计及其对靶mRNA的切割

目的：针对ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列设计核酶，探讨生理温度下核酶的切割活性，方法：计算机模拟分析ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分二级结构，选择核酶切位点，设计核酶，分别构建ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列和核酶体外转录载体并经双脱氧末端终止法测定核酶序列正确无误，体外转录核酶和靶ＲＮＡ分子，生理温度下测定核酶切割活性，结果：所设计的核酶可有效地切割靶ｍＲＮＡ分子。结论：所设计的核酶在生理温度下具     

实验感染的猕猴血清和粪便中HEVRNA动态变化研究

应用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法检测实验感染ＨＥＶ猕猴急性期血清及粪便标本中ＨＥＶＲＮＡ，并与其血清ＡＬＴ异常和抗－ＨＥＶＩｇＧ阳转相比较，以了解猕猴感染ＨＥＶ后上述各项标志的动态变化规律。结果表明，ＨＥＶＲＮＡ血症多出现于ＡＬＴ升高之前，持续约１～２周，当血清抗－ＨＥＶｌｇＧ阳转时ＨＥＶＲＮＡ即转为阴性；粪便ＨＥＶＲＮＡ可与病毒血症同时出现，但持续时间较病毒血症为长，于感染后３～４周仍可检测到。     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

献血员庚型肝炎病毒感染对照研究

目的 了解职业献血员与义务献血员庚型肝炎病毒感染状况。方法 采用ＥＬＡ法检测抗－ＨＧＶ、ＰＣＰ法检测ＨＧＶ－ＲＮＡ。结果 检测职业血员１８０例血清标本中抗－ＨＧＶ阳性２１例，阳性率８．５７％，ＨＧＶＲＮＡ阳性１８例，阳性率占抗ＨＧＶ的８５．７％；义务献血员１１５例血清标本中抗－ＨＧＶ阳性３例，阳性率２．６％，ＨＧＶＲＮＡ阳性２例，阳性率占抗ＨＧＶ的６６．６６％。结论 义务献血可显著降低庚型肝炎病毒