利用SOE-PCR技术构建eglAp-rhIL-12融合基因的条件优化

目的利用SOE-PCR技术连接丙酮丁醇梭菌内源性β1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽(eglAp)与重组人白细胞介素12(rhIL-12)序列,构建融合基因eglAp-rhIL-12;优化SOE-PCR反应中的主要条件,获得具有可重复性的SOE-PCR方法。方法通过PCR得到eglAp的3′端和rhIL-12的5′端重叠的两个基因序列;通过调整SOE-PCR体系中模板eglAp和rhIL-12的量及比例,得到目的产物;通过调整退火温度及引物量提高扩增产物特异性。结果当SOE-PCR满足以下条件时即可获得高纯度高丰度目的产物:25μL PCR反应体系中,eglAp和rhIL-12的两个模板量分别为5～10ng,摩尔比为5∶1(质量比1∶1);在不加引物的情况下,退火温度设定为71℃,扩增3个循环,然后加入0.4μL引物(10μmol/L),退火温度设定为61.3℃,扩增28个循环。结论 SOE-PCR成功的关键在于调整好模板的比例和浓度,即质量比1∶1,模板量不要少于5ng(25μL PCR体系);若要获得高纯度高丰度的连接产物,则需要适当提高退火温度和减少引物量。     

获得重构基因的简捷方法--重叠延伸PCR

目的：构建IFN-β信号肽序列与白细胞介素18（IL-18）成熟肽的重组嵌合分子。方法：从BALB/c鼠基因组DNA扩增IFN-β信号肽序列;由小鼠Pro-IL-18真核表达质粒获得IL-18成熟肽序列;以非对称PCR技术得到IFN-β信号肽编码区的反义链和IL-18成熟肽正链;采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生具有IFN-β信号肽与IL-18成熟肽的嵌合编码序列;定向连方式构建嵌合IL-18的表达质粒并测序。结果：连续胶PAGE表明非对称PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链,大小符合预期。IFN-β信号肽对称PCR产物与IL-18非对称PCR产物混合作为模板,进行重叠延伸;电泳分析可见清晰的嵌合片段;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成,且无移码。 结论：重叠延伸PCR是一种获得重构基因的简捷方法。     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

重叠延伸PCR法在合成人骨保护素N端编码序列中的应用

目的：获得人骨保护素(OPG)N端D1-D4结构域编码序列。方法：OPGN端D1-D4域仅由2个外显子编码。采用改良方法自人血标本提取基因组DNA，以此DNA作为模板，PCR分别扩增OPG基因外显子2和外显子3，并使外显子2的3’引物和外显子3的5’引物具有相互重叠的一段序列。以2种PCR产物的混合物作为模板，采用重叠延伸法再次进行PCR，扩增产物克隆于载体pGEM—Teasy进行序列分析。结果：PCR扩增得到N端编码序列，序列分析证实该序列完全正确。结论：重叠延伸PCR法合成人OPGN端编码序列的完成为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的 基于重叠延伸PCR（SOE PCR）技术构建转录因子EB（TFEB）丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。 方法 根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_n和R_n进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌（E.coli）中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。 结果 第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸（TCT）成功突变为丙氨酸（GCT）。在0.5?mmol·L^－1 IPTG、16?℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。 结论 利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。     

基因组简并寡核苷酸引物聚合酶链反应的影响因素

目的:对影响现有微量基因组扩增方法--简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotideprimed PCR,DOP-PCR)的因素进行探讨.方法:针对现有DOP-PCR扩增过程中存在的影响产物产量和特异性的因素进行分析,分别从不同的DNA模板来源、模板梯度稀释与否以及DOP-PCR扩增产物是否采用低熔点胶回收去除干扰分析的小片段等方面进行研究,最后以特异性基因(FTCD和CBS)PCR扩增的结果作为评价指标,了解上述因素对DOP-PCR扩增的影响.结果:以小鼠单个卵细胞基因组为模板与以肝基因组DNA为模板相比,在产量上前者明显低于后者,特异性上两者相当.小鼠肝基因组DNA梯度稀释作为模板进行扩增的结果没有明显差异.与未经低熔点胶回收的DOP-PCR产物相比,经低熔点胶回收的DOP-PCR产物在常规PCR扩增反应中得到的产物特异性更好.结论:应用DOP-PCR方法进行扩增时,小鼠单个卵细胞可以用来进行DOP-PCR的扩增从而用于对特异性基因的检测,但是在扩增产量方面需要进一步的改进或优化.对现有DOP-PCR反应进行产物低熔点胶回收纯化,能够增加产物的特异性,效果满意.     

应用聚合酶链反应扩增HIV—1gag基因序列

作者设计了一对DNA引物,用于扩增1型人免疫缺陷病毒(HIV—1)gag基因的一段保守序列。应用聚合酶链反应(PCR)技术,采用含有ARV-2gag基因的亚克隆质粒pAG423作模板,可以使靶基因片段数目增加1×10~7倍以上,经电泳染色后,扩增产物清晰可辨。实验结果表明,这种方法的敏感性极高,足以检测到6.5个拷贝的HIV-1基因。用特异性DNA探针打点杂交证实扩增产物为特异性gag基因片段。实验还表明,经过30～35次PCR循环可以得到最佳扩增效果,而且应用PCR和打点杂交方法还可以对HIV-1基因进行定量分析。因而PCR是一种可以取代病毒分离的常规测定HIV-1感染的简便方法。     

体外转录法制备SARS冠状病毒RNA片段

目的通过体外转录获得SARS冠状病毒RNA片段,为建立RT-PCR和荧光定量PCR诊断方法提供阳性对照.方法根据GenBank登录SARS冠状病毒Tor2株基因组序列,选择基因组中18138-18327nt作为目的扩增序列,并将其分解为首尾重叠的3个片段,人工合成对应的单链DNA序列,通过退火延伸获得全长dsDNA片段,PCR扩增该片段后,连接至载体pMD18T上,筛选含目的插入片段的阳性重组质粒pMD 18T-SARS,用BamH Ⅰ和HindⅢ切出目的片段,连接至线性化表达性质粒pGEM上;筛选阳性重组质粒pGEM-SARS,测序鉴定后,经HindⅢ酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,得到含SARS冠状病毒目的序列的RNA片段,转录产物经电泳观察后,用RT-PCR验证.结果获得含SARS冠状病毒目的基因序列的RNA片段.结论该RNA片段可用于SARS冠状病毒RT-PCR和荧光定量RT-PCR诊断方法的阳性对照.     

一种高效扩增小片段DNA方法的建立

目的建立一种高效扩增小片段DNA的方法。方法 本方法利用单链DNA连接酶(single strand DNA ligase,ssDNA ligase)可以连接单链DNA的性质将小片段DNA自连成环,随后利用phi29DNA聚合酶进行恒温的滚环复制,将扩增产物进行酶切,得到了扩增后的小片段DNA。结果 单链DNA连接酶可以有效的将30bp的小片段DNA自连成环,phi29DNA聚合酶可以扩增出大于10kb的DNA片段,扩增产物经酶切后又可进行第二轮扩增,并且证明了其成环方式为自成环。结论 通过单链成环后滚环复制的这种方法可以有效的将小片段DNA进行扩增,解决了PCR无法扩增小片段DNA的问题,并有着广阔的应用前景。     

聚合酶链反应扩增大片段mtDNA

目的 :探讨聚合酶链反应 (PCR)扩增大片段线粒体DNA方法。方法 :快速碱裂解法提取线粒体DNA ,长时程PCR扩增出 5 430bp线粒体DNA。结果 :扩增出 5 430bp线粒体DNA产物特异性强 ,产量高。 结论 :该方法反应条件简便、稳定 ,也可用于其它大片段的扩增 ,有一定的实用价值。     

应用PCR快速诊断小儿结核性脑膜炎的研究

作者报道特异性寡核苷酸引物引导聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ。所用引物来自于编码结核杆菌的６５ＫＤａ蛋白质抗原基因，产生特异的３８３ｂｐ片段。对１０倍连续稀释的人型结核杆菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ，可检测出１ｐｇ结核杆菌ＤＮＡ，相当于１０～１００个细菌。应用ＰＣＲ检测４２例结脑脑脊液，阳性率为５７．１４％，直接涂片镜检和细胞培养阳性率分别为７．１４％和１４．２８％；４６例非结脑脑脊液中，３种检测结果均阴性。研究结果表明，ＰＣＲ检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ有较高的敏感性和特异性，它快速、简便，有望成为一种临床常规检测结核杆菌方法。     

鉴定定量PCR不同引物对的扩增效率

目的:采用载体构建及荧光定量PCR的方法比较BCL2等位基因不同部位PCR引物在定量分析中的扩增效率,判断其用于不同等位基因转录活性分析的可靠性。方法:用PCR扩增包含定量PCR目的片段的序列,然后将扩增产物分别插入pGEM-TEasy载体中,构建TA3重组载体,再以TA3载体为模板,采用荧光定量PCR方法比较引物对之间扩增效率。结果:定量PCR结果显示引物对之间扩增效率无明显差异。结论:所检测的PCR引物对之间的扩增效率一致,可用于比较分析mbr /mbr-Nalm-6杂合子细胞系中两个等位基因表达活性。     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

IRM-2小鼠cDNA文库的全长cDNA序列分析

目的分析IRM-2小鼠全长cDNA文库的cDNA序列。方法根据IRM-2小鼠的21条EST,从IRM-2小鼠全长cDNA文库测定基于该21条EST序列PCR扩增的全长cDNA序列,通过与GenBank基因库同源序列信息比对,分析全长cDNA序列和性质。结果根据21对引物PCR产物的拼接,获得5条全长cDNA序列,与小鼠已知基因不同源,而且得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的性质。结论 5条全长cDNA序列提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

长链PCR在中国汉族人多囊肾病1型致病基因突变检测中的应用

目的:研究特异性分离中国汉族人多囊肾病1型致病基因(polycystic kidney disease gene 1,PKD1)多拷贝区的方法,以排除同源序列对该基因突变检测的干扰.方法:利用与同源序列间的个别碱基差异设计8对能涵盖PKD1多拷贝区的长链PCR引物,分别对两例健康汉族人基因组DNA进行PCR,其扩增产物通过巢式PCR进行序列测定.结果:通过优化PCR体系,尤其是以高质量基因组DNA为模板,适当提高退火温度,经巢式PCR测序证实扩增产物序列与PKD1多拷贝区一致.结论:该研究采用的长链PCR体系可克服同源序列的影响,适用于中国汉族人PKD1多拷贝区的特异性扩增,为进一步通过单链构象多态性分析检测汉族人PKD1突变位点奠定基础.     

广地龙特异性引物序列的设计及其混伪品的鉴别

目的?通过设计特异性引物来鉴定广地龙及其混伪品。方法?提取广地龙及其混伪品的DNA。利用通用引物COⅠ序列对广地龙及其混伪品进行PCR扩增,并对扩增产物进行双向测序。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,找出广地龙的变异位点,设计出广地龙的特异性引物,用于广地龙及其混伪品的鉴定。对PCR反应条件退火温度、循环次数、DNA模板量和Taq酶用量进行适应性考察。结果?COⅠ序列不存在特异性,不同物种、不同品种的动物药均可扩增出750?bp大小的片段,无法鉴定广地龙及其混伪品。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,设计出广地龙的特异性引物PA-f/PA-r。在建立的PCR反应体系中,只有广地龙可以获得574?bp的基因片段,其他混伪品未扩增出相应条带。结论?设计的广地龙特异性引物可以准确、成功鉴别广地龙,与其他混伪品区分,为广地龙的品种鉴别提供了有效的方法。      

PCR-ELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用

目的 建立灵敏，快速，特异的PCR-ELISA检测结核菌DNA的方法。方法 用一对生物素标记的上游引物和未标记的下游引物对TBIS6110的一段DNA进行快速PCR扩增，使扩增产物的一条链上带有生物素，同时PCR反应液中存在有地高辛的标记的检测探针，随着PCR的结束，探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体，该杂交体通过链霉亲和素被固定在微孔板表面，然后用标记有过氧化物酶的地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合，漂洗后加底物显色。测定吸光度值（A450nm)。结果 该方法灵敏，特异，快速，可以检测出10copies的模板量，对临床60例痰标本进行培养法。结论 该方法适用于临床进行快速的TB基因检测，也可用于其它病原体的检测。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.