应用PCR快速诊断小儿结核性脑膜炎的研究

作者报道特异性寡核苷酸引物引导聚合酶链反应技术检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ。所用引物来自于编码结核杆菌的６５ＫＤａ蛋白质抗原基因，产生特异的３８３ｂｐ片段。对１０倍连续稀释的人型结核杆菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ，可检测出１ｐｇ结核杆菌ＤＮＡ，相当于１０－１００个细胞。应用ＰＣＲ检测４２例结脑脑脊液，阳性率为５７．１４％，直接涂片镜和细胞培养阳性率分别为７．１４％和１４．２８％；４６例非结脑脑脊液中，３种检测     

聚合酶链反应在结核性脑膜炎早期快速诊断中的价值

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测１４例结脑患者脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ，并与细菌培养、Ｅｌｉｓａ法比较，三种方法的敏感性和特异性分别为８５．７１％和１００％，２１．４３％和１００％，５０％和９５．０％。２０例对照组中，ＰＣＲ均为阴性。结脑组与对照组相比差异显著（Ｐ〈０．０１）。作者认为，ＰＣＲ是目前结脑最敏感和特异的早期、快速病原学诊断方法，值得临床推广。     

PCR在结核性脑膜炎诊断中的应用

目的 探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）在结核性脑膜炎诊断中的应用。方法 采用ＰＣＲ技术检测结核性脑膜炎（结脑）患者脑脊液（Ｃｓｆ）中结核杆菌（ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｉ,ＴＢ）３０例。结果 结脑患者Ｃｓｆ中ＴＢ阳性率为７０％。结论：ＰＣＲ技术对结脑的快速、敏感、特异性诊断具有广泛的应用前景。     

用聚合酶链反应技术诊断结核病

用聚合酶链反应技术对结核杆菌特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因１２３ｂＰ的片段进行扩增。该法检测人型结核杆菌灵敏度可达到１０ｆｇＤＮＡ，对１４９份结核患者临床标本检测结果显示ＰＣＲ总阳性率（６９．１％）明显高于直接涂片荧光镜检（１５．４％）与细菌培养（１０．１％）的阳性率（Ｐ＜０．０１）。研究表明ＰＣＲ是一种特异、敏感、快速诊断结核病的好方法，值得推广。     

聚合酶链反应检测泌尿系结核患者尿中结核杆菌

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对３４例泌尿系结核病人的２４小时尿液标本进行结核杆菌染色体中３３６－ｂｐ重复序列ＤＮＡ片段的扩增检测，阳性率为９４．１％。ＰＣＲ检测２４小时尿样中结核杆菌比尿沉淀物涂片法找抗酸杆菌（阳性率５６％）及结核杆菌快速培养法Ｂａｃｔｅｃ培养结核杆菌（阳性率７０．６％）更敏感。我们还用ＰＣＲ、涂片法、Ｂａｃｔｅｃ培养法检测了１０例非泌尿系结核者中结核杆菌，阳性结果分别为０、０、３     

聚合酶链反应在732份临床标本检测中的应用

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测７３２份痰、血清、尿、分泌物、胸腹水、脑脊液等临床标本中之结核杆菌、乙型肝炎病毒和淋球菌的ＤＮＡ。结果表明，活动性肺结核病人痰标本阳性率最高，达７４．２３％；乙型肝炎病毒阳性率为３２，１４～６９．２３％，淋球菌阳性率为４４．１２％，内一例病人分泌物涂片阴性而ＰＣＲ阳性。本技术具有灵敏、特异、简便、快速和不需培养等优点，适合于临床应用。     

采用聚合酶链反应检测肺结核病患者中的结核杆菌

目的：建立一种快速，敏感及特异的早期诊断肺结核病方法。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测了６４例肺结核患者的外周血与痰标本结核杆菌－ＤＮＡ。结果：外周血结核杆菌－ＤＮＡ的阳性率为６７．２％（４３／６４），痰标本的阳性率为２９．６％（１９／６４）（Ｐ〈０．０５），结论：用ＰＣＲ技术诊断肺结核病，可提高临床检测的特异性和敏感性。     

肺结核患者外周血中结核杆菌DNA检测的意义

用ＰＣＲ技术对肺强核患者外周血１０８例和痰９６例中结核杆菌ＤＮＡ进行检测，结果患者外周血和痰中结核杆菌ＤＮＡ阳性率分别为７７．７８％和５７．２９％；其中５２例患者外周血和痰标本配对同时检测总阳性率达９２．３％，提示外周血结核杆菌ＤＮＡ检测可提高肺结核诊断敏感性和阳性检出率，可作为肺结核诊断有用的指标。     

立克次体感染的PCR检测

作者应用ＰＣＲ技术对３０例疑似立克次体感染或不明热患者的血液标本和／或立克次体细胞分离培养物进行立克次体特异性ＤＮＡ检测。用Ｒｒ．１９０．７０ｐ、Ｒ．ｒ．１９０６０２ｎ，Ｒｒ．１７ＫＤ，ｓｔａ５８３种引物对分别进行ＤＮＡ扩增，共检出斑点热群立克次体特异性ＤＮＡ１１份，斑疹伤寒立克次体特异性ＤＮＡ４份，恙虫病立克次体特异性ＤＮＡ４份，其中有１０份血液标本在分离前用Ｒｐ．Ｃ．Ｓ．引物进行ＰＣＲ检测，检出立克次体属ＤＮＡ７份，分离培养后再取分离培养物和阳性血液标本同法用Ｒｒ．１９０．７０ｐ、Ｒ．ｒ．１９０６０２ｎ，Ｒｒ．１７ＫＤ，ｓｔａ５８３种引物对分别进行ＰＣＲ检测，分离前后所得结果一致     

PCR快速检测结核杆菌的临床应用

本文应用聚合酶链反应技术对２８５例痰液、９２例胸水、３８例脑脊液标本中的结核杆菌进行了快速检测。ＰＣＲ法的敏感性为１００％，阳性率分别为２７．４％、２１．７％、１８．４％，明显高于浓缩集菌涂片法，另外对２５例结核病患者痰标本用酶法和热裂解法提取结核杆菌ＤＮＡ获得了相同的敏感性。     

等位基因特异性多重PCR快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的初步研究

目的建立等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele-specific PCR,MAS-PCR)技术,以快速检测结核分枝杆菌对喹诺酮的耐药性。方法根据结核分枝杆菌gyrA基因序列,分别设计4条特异性寡聚核苷酸引物,优化PCR条件,建立针对gyrA基因90和94位点突变进行检测的MAS-PCR技术,对临床分离菌株进行喹诺酮耐药性检测,同时以比例法和DNA直接测序法做对照。结果共对144株喹诺酮敏感株和56株喹诺酮耐药株进行了MAS-PCR检测。MAS-PCR与比例法比较,敏感性为53.57%(30/56);与DNA测序比较,敏感性为71.43%(30/42),特异性均为100%(144/144)。结论 MAS-PCR技术检测结核分枝杆菌对喹诺酮耐药性简便、快速、特异性高,但敏感性需进一步提高。     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用

目的 建立结核分枝杆菌的分子信标荧光定量PCR检测方法 ,探讨该方法 检测结核分枝杆菌的临床应用价值.方法 针对结核分枝杆菌Ag85B DNA特异保守序列设计引物和分子信标探针,并构建标准品.采用分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法、集菌培养法检测158例肺结核患者痰液标本,比较3种方法 的检出率.结果 所建立方法 最低检测限度为2个基因拷贝/反应,在2×10~2～2×10~8基因拷贝/mL范围内,Ct值同DNA量的对数呈线性关系.该方法 检测5株非分枝杆菌和6株非结核分枝杆菌结果 均为阴性,检测结核分枝杆菌H37Rv出现75 bp特异条带.分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法、集菌培养法阳性检出率分别为60.13%、16.46%、31.01%,荧光定量PCR法检出率明显高于抗酸染色法和集菌培养法.结论 分子信标荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异度,对结核病的诊断有一定的临床意义.     

PCR技术快速检测结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的研究

采用 PCR 技术体外 DNA 扩增,检测结核分枝杆菌,扩增片断为165 bp,非肺结核分枝杆菌及其它细菌结果阴性,证实其具有较高的特异性。通过与常规 DNA 制备方法的比较,证明对脑脊液标本煮沸后进行直接圹增,方便、快捷,节省费用,不影响实验结果,值得推广。通过对33例结核性脑膜炎(结脑)及26例非结脑患者脑脊液进行结核分枝杆菌 DNA 检测,并与其它诊断方法进行比较,结果显示 PCR 的阳性率为84.8%(28/33),染色镜检3%(1/33),抗原检测60.6%(20/33),抗体检测54.5%(18/33),对照组无一例扩增阳性,表明 PCR 技术在特异性和敏感性方面均优于其它方法(P<0.01),可望成为结脑可靠的诊断手段。     

多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体

目的 建立脑膜炎多重PCR检测系统,以在一次扩增中快速、特异地同时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌,用于脑膜炎病原体感染的快速诊断。方法 根据新型隐球菌URA保守序列、脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列、结核分枝杆菌基因组中的IS986插入基因序列片段,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用多重PCR技术,同时检出脑脊液中的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌。结果 应用多重PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果：我重PCR扩增的预期结果为：单一菌感染出现一条特异性扩增区带;混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带,经实验达到预期的扩增结果;对15份已明确诊断的脑脊液标本,分法均能扩增出预期的目的片段。符合率达100%,对20例临床脑脊液标本的PCR扩增结果分别为：新型隐球菌15%（3/20）、结核肝菌20%（5/20）、脑膜炎双球菌10%（2/20）。结论 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染,以及原因不明的脑膜炎患的快速诊断,提供了快速、准确的诊断手段。有效地减少了脑膜炎的误诊和漏诊,更提高了检验效率。     

巢式PCR法在结核病与结节病鉴别中的应用

目的观察结核病和结节病病理组织中结核分支杆菌DNA检出情况，探讨巢式PCR方法在结核病与结节病鉴别中的作用。方法以结核分支杆菌内插入序列IS6110为扩增靶序列，用巢式PCR法检测37例结核病和31例结节病石蜡包埋病理组织中结核菌DNA，以H37RV标准结核菌株作阳性对照，鼠胎肺作阴性对照，并与同步进行的普通PCR结果作比较。结果对照组分别均为阳性及阴性结果，37例结核病组中36例呈阳性结果（阳性率为97．3％），31例结节病组中8例呈阳性结果（阳性率为25．8％），经统计学分析两组阳性率有显著差异；与普通PCR方法比。采用巢式PCR方法对结核菌DNA检出阳性率明显提高。结论用巢式PCR法检测石蜡包埋病理组织中结核菌DNA可作为鉴别结核病和结节病的方法之一。     

结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用

目的 建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测体系,并用于不同类型临床样本的检测.方法 常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA,9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA,12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA.设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针,建立ddPCR检测体系.应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数,进行统计学分析.结果 建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系,该体系检测2个靶标的线性范围分别为0.5～8 733和0.2～2 893拷贝/μl反应体系.该体系具有较好的重复性(r＞0.95),以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％.在痰和血浆DNA样本检测中,2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组.结论 结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系,可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测,对提高结核病病原学诊断能力有重要意义.     

Polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis

Polymerase chain reaction (PCR) based on the amplification of a 169 bp DNA fragment specific for the Mycobacterium tuberculosis complex was evaluated for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis (TBM). A total of 105 CSF specimens from clinically suspected cases of TBM were studied. Clinical details of the cases and cytochemical parameters of the CSF specimens were recorded. For PCR 10 CSF specimens from cases other than TBM, 4 non-mycobacterial culture isolates (one strain of E coli, one strain of proteus species and 2 strains of salmonella species) and one sample of sterile distilled water were processed as negative controls. For positive control standard culture of Mycobacterium tuberculosis H37Rv was processed with every batch of specimens. Besides PCR, smear for AFB by the Ziehl-Neelsen (ZN) and the fluorochrome method and culture on Lowenstein-Jensen medium was also carried out. By PCR, 31.42% specimens were found positive, whereas by conventional culture on Lowenstein-Jensen medium only 3.8% specimens were positive.