刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达

目的：构建天花粉蛋白（TCS）突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法：借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇（YFF81-83）并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot鉴定。最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果：成功构建了TCS突变体（TCSYFF81-83ACS）,并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论：TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

目的：利用聚合酶链反应（PCR）技术对Wilson病（WD）基因进行体外定点突变的研究。方法：采用PCR定点突变技术，首先设计两对引物，将突变位点设计在引物上，通过重叠延伸法两次PCR扩增，扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。结果：DNA测序表明在预期位点已经发生突变，WD基因第778位密码子由精氨酸（Arg)残基突变为亮氨酸残基（Leu),用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。结论：PCR技术诱导定点突变准确，高效。Wilson病基因突变体的构建成功，为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建

目的：定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体。 方法：以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设 计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩 增片段克隆入pcDNA3.1载体中。 结果：在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸（cgc）突变为组氨酸（cac）,第248位密码子由精氨酸（cgg）突变为色氨酸（tgg）,第273位密码子由精氨酸（cgt）突变为组氨酸（cat）。p53基因突变子表达载体成功构建。 结论：PCR技术诱导定点突变准确、高效。基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位 点奠定了基础。     

β-半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析

目的构建含ε-NH2标记位点的克隆酶供体免疫分析（CEDIA）系统供体片段。方法从大肠杆菌基因组克隆β-半乳糖苷酶（β-gal）的α片段基因,通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变,与硫氧环蛋白（Trx）融合表达后与Δα片段进行酶学互补活性分析。结果克隆的α片段为β-galN端1-56多肽片段,定点突变得R14K、R53K和R14K/R53K等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上,且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性,其中R53K突变体的活性远高于R14K和R14K/R53K的,且与野生型α片段的基本一致。结论α片段R53K突变体具有作为CEDIA系统含内部标记位点供体的潜力。     

生殖支原体MG 427原核表达载体的构建和鉴定

目的：构建生殖支原体MG427基因原核表达载体并进行鉴定。方法以生殖支原体标准株G37 DNA为模板进行PCR扩增mg 427基因,克隆入原核表达载体pGEX-6 p-1。定点诱导该基因中第289～291位核苷酸TGA密码子突变成TGG,构建pGEX-6 p-1/MG 427的原核表达载体。结果成功扩增出大约426bp的基因片段,定点诱导突变后,经酶切及测序鉴定证明mg 427中的TGA被成功突变为TGG,与目的基因相符。结论成功构建生殖支原体渗透压诱导蛋白MG 427原核表达载体pGEX-6 p-1/MG 427。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究,并构建携带有基因突变K317N的pRc/CMV-hH1的表达载体。方法采用PCR定点突变技术,根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI/Sse8387I设计一对定点诱变引物,将突变位点设计在引物上,通过PCR扩增,使扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV-hH1载体中。结果DNA测序表明,在预期位点巳经发生突变,SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N),成功实现定点诱变。结论PCR技术诱导定点突变,准确、高效。pRc/CMV-hH1(K317N)的成功构建,为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

FGF21[Tyr20]突变体的克隆、表达及纯化

目的：将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法：以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物（SUMO）融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］,克隆至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,Sephadex G-50除盐。结果：通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论：成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21［Tyr²⁰］的突变体基因,获得FGF21［Tyr²⁰］蛋白。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

蜂毒肽与变构hIL－2融合基因原核表达载体的构建

目的构建蜂毒肽与人变构白细胞介素－2原核表达载体，为进一步研究该融合基因而奠定基础。方法以本室构建质粒pGEX－4T-2／Melittin－IL－2（^88Arg）为模板，设计引物，用PCR定点突变的方法将IL-2部分的^125Cys突变为Ala，PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌，小提质粒，DNA测序后再将目的片段连接于pET-15b，最后酶切鉴定。结果PCR产物542bp，构建质粒双酶切、DNA测序鉴定如预期。结论成功构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体。     

家族性进行性色素过度沉着症家系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11基因的克隆和序列鉴定

目的进行家族性进行性色素过度沉着症(FPH)家系中患者丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(STK11)基因的克隆和序列鉴定,以期检测FPH发生是否由于STK11突变所致。方法从FPH患者永生化的B淋巴细胞中提取总RNA,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获取cDNA序列,加入特异性引物经PCR扩增STK11 cDNA双链,再经过HindⅢ、EcoRI双酶切PCR产物及质粒载体pcDNA3.0,酶切产物经回收、连接,产物转化到大肠杆菌DH5α,选取阳性克隆菌落进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析。结果成功构建重组质粒pcDNA3.0-STK11,其测序结果与美国国立生物技术信息中心查询的正常序列结果一致。结论该FPH家系发病并非由于STK11突变所致,在初步定位FPH致病基因的19p13.1-pter区段存在尚未发现的致病基因。     

基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的 基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。 结果 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^－1,纯度为1.50~1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56 ℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^－1 mg·L^－1;稳定性检测,多重PCR体系自制备起每6个月检测稳定性一致。 结论 建立的多重PCR检测体系对于蜡样芽胞杆菌nhe499、cytK191和entFM363 3种毒素基因灵敏度高、特异性强,检测结果准确稳定,检测体系具有良好稳定性,适用于快速检出蜡样芽胞杆菌的3种不同致病毒素基因。     

肿瘤归巢肽-近红外荧光蛋白融合蛋白的制备及其荧光特性

目的 构建肿瘤归巢肽（THPs）-近红外荧光蛋白（NIRFP）miRFP670- LyP1融合蛋白的原核表达载体,纯化融合蛋白,研究融合蛋白的近红外荧光特性。 方法 采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ对pmiRFP670-N1质粒和pET-28a质粒进行双酶切,构建pET-miRFP670原核表达载体,通过点突变引入LyP-1的DNA序列,构建重组表达载体pET-miRFP670-LyP1;将测序正确的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21细胞中,SDS-PAGE电泳法检测不同温度（16 ℃和37 ℃）、不同异丙基硫代半乳糖苷浓度（0.1、0.5和1.0 mmol·L^－1）诱导下融合蛋白原核表达量;采用Ni-NTA树脂亲和纯化融合蛋白,检测miRFP670-LyP1蛋白原核表达量;采用荧光显微镜观察乳腺癌4T1细胞中miRFP670-LyP1融合蛋白的细胞内吞形态表现。 结果 检测到长度约为5 343和973 bp的DNA条带,与pET-28a载体及miRFP670基因片段大小相符。DNA测序,LyP1序列成功插入至pET-miRFP670表达载体中。在16 ℃时miRFP670-LyP1融合蛋白的可溶性蛋白表达量较37 ℃时更高。采用Ni-NTA树脂纯化得到了高纯度的miRFP670-LyP1融合蛋白。荧光成像,miRFP670-LyP1融合蛋白可被乳腺癌4T1细胞高效内吞。 结论 成功构建了pET-miRFP670-LyP1原核表达载体,融合蛋白在低温（16 ℃）较常温（37 ℃）诱导的可溶性蛋白表达量更高,亲和层析得到了高纯度的融合蛋白,融合蛋白被乳腺癌4T1细胞高效内吞并显示出近红外荧光。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

人DNMT 3B7真核表达载体的构建和鉴定

目的构建人DNMT3B7真核表达载体pCMV-DNMT3B7。方法据Genebank中人DNMT3B7cDNA序列设计并合成特异性引物,以人DNMT3B1为模板,利用PCR技术扩增出DNMT3B7,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。结果 PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B7。结论成功构建了人DNMT3B7真核表达载体,为进一步研究DNMT3B异构体提供了条件。     

Rb2/p130寡核苷酸基因芯片的制备及肺癌手术标本的检测

目的：用基因芯片方法检测肺癌标本中Rb2/p130基因的点突变情况,为肺癌诊断探索快速、准确的基因检测途径。方法：收集肺癌患者的手术标本,提取基因组DNA,检索Rb2/p130基因的DNA序列后,设计并合成探针和引物序列,将探针按一定顺序点样于醛基化玻片,制备成基因芯片。用荧光标记引物对肺癌标本DNA进行PCR扩增,扩增产物与基因芯片杂交,通过对杂交信号的检测判断是否发生热点突变,并用测序方法对突变位点进行验证。结果：在30例用寡核苷酸基因芯片的方法检测的肺癌标本中,Rb2/p130基因突变的检出率为16.67%,其中肺腺癌的突变率为20%（4/20）,肺鳞癌的突变率16.67%（1/6）;在检测过程中发现PCR产物浓度和杂交温度是影响结果的关键因素,对突变位点的测序证实了基因芯片的结果。结论：基因芯片法检测出中国人肺癌组织标本存在Rb2/p130基因突变,但突变率（16.67%）低于西方人（78.5%）。未能检测全部突变位点、标本量小和人种差异可能是低突变率的原因。     

大鼠锌指蛋白ZFP580的原核表达与分离纯化

【目的】构建ZFP580基因的原核表达质粒,转化大肠杆菌,诱导表达并分离纯化大鼠锌指蛋白ZFP580。【方法】根据ZFP580 cDNA序列的开放阅读框设计引物,利用PCR技术扩增ZFP580的开放阅读框cDNA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,Nco I、Xho I双酶切电泳筛选、鉴定并测序。将构建的重组质粒pET30a-ZFP580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。【结果】成功扩增ZFP580基因并构建了表达质粒pET30a-ZFP580,测序结果表明与GeneBank公布的序列一致。含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa。【结论】成功表达并纯化了大鼠ZFP580蛋白,为进一步研究锌指蛋白ZFP580的功能奠定了基础。     

小鼠胸腺输出功能及免疫重建的研究方法

目的建立实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTREC）水平和T细胞受体β链可变区（TRBV）CDR3的方法,推测其中的初始T细胞的数目和克隆性,评价胸腺输出功能及免疫重建,从而为胸腺输出功能及移植后T细胞免疫提供可靠的研究方法。方法分别提取小鼠脾脏细胞基因组DNA和总RNA。PCR方法扩增DNA标本目的片段。纯化鉴定并构建含sjTREC片段的质粒标准品。建立稳定的实时定量PCR反应检测小鼠脾脏淋巴细胞sjTREC含量的方法。采用半巢式PCR扩增TRBV基因产物,采用ABI3700分析TRBV谱型。结果构建了可靠的sjTREC和TCRα质粒标准品。在实时定量PCR中建立了可靠的标准曲线。建立的定量PCR方法分析可成功用于脾细胞的sjTREC含量的检测。8周龄BALB/c小鼠脾细胞sjTREC含量为（626±115）拷贝/10^5个脾细胞。结论建立了可靠的定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTREC含量的方法,建立了分析T细胞谱型的方法,为研究生理和病理条件下胸腺输出功能及T细胞免疫重建改变提供了可靠的方法。