骨髓基质干细胞移植对脑损伤大鼠神经行为学和血管再生的影响

目的探索移植骨髓基质干细胞(BMSCs)对局灶性脑损伤大鼠的神经功能修复的作用及血管再生的影响,探讨BMSCs移植促进大鼠脑损伤修复的机制。方法 30只大鼠制备大鼠局灶性脑损伤动物模型,随机分为假手术组、脑损伤组和BMSCs移植组,每组10只大鼠。取供体鼠BMSCs,体外扩增,DAPI荧光标记。在脑立体定向仪引导下将BMSCs移植到脑损伤大鼠局部损伤灶边缘,于3d、7d及14d通过观察大鼠神经行为能力的变化,评价移植细胞后大鼠神经功能的修复情况;14d后取脑组织荧光显微镜观察移植细胞存活的情况,采用免疫组化法检测脑组织微血管密度(MVD)来评估血管再生情况、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(Flt-1、Flk-1)的蛋白表达情况。结果脑损伤组和BMSCs移植组于移植后3d时神经行为学评分差异无统计学意义(P>0.05),而在移植后7d、14d,BMSCs移植组与脑损伤组在神经行为学评分指标上差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs移植组与脑损伤组比较,脑组织微血管密度明显增加,VEGF和Flt-1、Flk-1表达明显增加。结论骨髓基质干细胞移植后可促进脑损伤大鼠神经功能的恢复,其机制可能与其增加VEGF和Flt-1、Flk-1表达促进血管再生有关。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染的骨髓基质细胞治疗脑梗死的疗效及机制研究

目的探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因转染的骨髓基质细胞(BMSCs)治疗脑梗死的疗效及机制。方法 135只SD大鼠随机分为假手术组(30只)、对照组(30只)、BMSCs组(30只)和GM-CSF-BMSCs组(45只)。采用线栓法制作短暂性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,24 h后分别将α-MEM培养基、BMSCs和GM-CSF基因转染的BMSCs植入到对照组、BMSCs组和GM-CSF-BMSCs组大鼠缺血脑组织周边区域(IBZ)。移植后第3 d、7 d和21 d进行神经损伤严重程度评分(NSS),并检测大鼠脑梗死体积及IBZ区域凋亡神经细胞数目。GM-CSF-BMSCs组采用荧光免疫组化染色方法检测植入细胞在大鼠IBZ局部的存活与分化。结果与对照组比较,BMSCs组细胞移植后21 d时NSS及脑梗死体积占半球体积百分值(HLV)明显下降(均P<0.05),细胞移植后3 d、7 d和21 d时凋亡细胞数明显下降(均P<0.05);GM-CSF-BMSCs组细胞移植后7 d、21 d时NSS及HLV明显下降(P<0.05~0.01),细胞移植后3 d、7 d和21 d时凋亡细胞数明显下降...     

脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞移植对神经功能和促血管生成素-1、2及其受体表达的影响

目的 探讨腩缺血恢复期骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对神经功能和促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)表达的影响.方法 42只SD大鼠随机分为脑缺血对照组(对照组,12只)、BMSC移植组(15只)及假手术组(15只),各组又分为缺血后28 d、35 d、42 d 3个亚组.用线栓法制作脑缺血大鼠模型,用改良黏附物移除试验(MST)评估大鼠神经功能.在脑缺血后21 d,给BMSCs移植组大鼠尾静脉注射BMSCs,对照组大鼠注射等体积PBS.在脑缺血后28 d、35 d、42 d(移植后7 d、14 d、21 d),用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western Blotting法检测大鼠缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的水平.结果 BMSCs移植组大鼠各时间点亚组的MST评分均显著高于对照组(均P<0.05);BMSCs移植组及对照组各时间点亚组脑组织的Ang-1、Tie-2 mRNA和蛋白水平明显高于假手术组(P<0.05～0.01),脑缺血后28 d、35 d,BMSCs移植组脑组织Ang-1、Tie-2 mRNA及蛋白水平均明显高于对照组(均P<0.01),而脑缺血后42 d两组之间的差异无统计学意义;3组各时间点亚组脑组织Ang-2 mRNA及蛋白水平的差异均无统计学意义.结论 脑缺血恢复期BMSCs移植能改善神经功能,并使缺血周围脑组织Ang-1、Tie-2的表达水平明显增高.而对Ang-2表达无明显影响.     

大鼠脑损伤后脑内移植骨髓基质细胞的研究

目的研究大鼠脑损伤后骨髓基质细胞(BMSCs)颅内移植对内源性神经干细胞(NSCs)的作用。方法 48只雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组、移植组、非移植组。大鼠脑损伤后24 h立体定向下局部注射BMSCs,然后每天腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)2次。损伤后14 d和28 d随机处死取脑,行BrdU免疫组化染色以及BrdU和神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化双染色。结果局部注射BMSCs的移植组大鼠表达BrdU/NSE阳性的细胞较非移植组为多。结论大鼠脑损伤后BMSCs对内源性NSCs的分化有促进作用。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑内出血

目的研究自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血大鼠的运动功能改善效果,以及采用不同移植方法后细胞在受损脑组织中的分布规律。方法采用立体定向技术向纹状体内注射自体新鲜心室腔血液构建SD大鼠脑出血模型,30只雄性SD大鼠随机分为A组:自然恢复组(对照组);B组:尾静脉移植组;C组:立体定向移植组,于移植后7 d、14 d进行神经功能缺损评分,并在荧光显微镜下观察BMSCs存活、迁移和分布情况。结果 C组大鼠神经功能恢复优于B组,BMSCs均能够迁移分布至大鼠脑损伤区。结论 BMSCs移植对脑出血后大鼠神经功能的恢复具有明显的促进作用。立体定向移植组大鼠神经功能恢复优于尾静脉移植组。     

骨髓基质细胞及血管内皮祖细胞共移植对局灶性脑缺血大鼠系列生长因子表达的影响

目的 观察经静脉移植骨髓基质细胞(BMSCs)及血管内皮祖细胞(EPCs)后血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、脑源性生长因子(BDNF)、胶质源性生长因子(GDNF)和神经生长因子(NGF)这9种细胞因子的表达. 方法 80只健康成年Wistar 大鼠按照随机数字表法分为模型对照组、BMSCs移植组、EPCs移植组及联合移植组,每组20只.线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型.造模24h后,分别取浓度为3x106个/mL的BMSCs、EPCs悬液及两者混合液1mL经鼠尾静脉移植入BMSCs移植组、EPCs移植组及联合移植组;模型对照组鼠尾静脉注射1 mL生理盐水.移植后7d,实时荧光PCR、Western boltting检测各组大鼠脑内生长因子的表达. 结果 联合移植组中bFGF、VEGF、BDNF mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).BMSCs移植组中NGF、GDNF、TGF-β mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),联合移植组次之.EPCs组中PDGF-BB、IGF-1、SDF-1 mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),联合移植组次之. 结论 BMSCs及EPCs联合静脉移植可上调脑内生长因子表达水平,为提高细胞移植效率提供了新的尝试途径.     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脑缺血损伤的实验研究

目的观察立体定向移植骨髓间充质干细胞(BMSC)治疗MCAO大鼠的效果并探讨其可能机制。方法用改良线拴法制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。60只模型大鼠随机分为移植组(A组)、磷酸盐缓冲液溶液组(B组)与假手术组(C组)。在模型建立后7 d,通过立体定向方式将1×106个BMSCs移植入A组大鼠损伤侧纹状体,B组大鼠以同样方式在同样部位移植等体积的磷酸盐缓冲液,C组完成立体定向过程,但无液体注入。应用改良大鼠神经功能缺损评分(m NSS评分)、水迷宫测试观察大鼠神经功能恢复状况,并取大鼠脑组织行免疫组织化学染色。结果 A组m NSS评分优于B组、C组(P0.05);A组逃避潜伏期明显缩短(P0.05);跨越平台次数明显增多(P0.05)。A组大鼠在脑损伤中心及周围区,可见Brdu单染阳性细胞及Brdu+BDNF、Brdu+GFAP、Brdu+v WF、Brdu+VEGF双染阳性细胞。结论立体定向移植BMSCs可以显著改善MCAO大鼠神经功能恢复。     

经枕大池移植神经干细胞治疗重型颅脑损伤大鼠的实验研究

目的探讨胎脑皮质来源的神经干细胞(NSC)用于重型颅脑损伤模型大鼠的治疗作用。方法用电子颅脑损伤仪制备重型颅脑损伤大鼠模型(n=46),随即分为神经干细胞治疗组(NSC组,n=23)和对照组(DMEM/F12组,n=23)。将胎鼠皮质来源的NSC经体外培养、扩增后用BrdU标记,经枕大池移植到模型大鼠的脑脊液中,于移植后24h,3d,7d,14d,21d,28d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(mNSS)的评估。对照组用相同体积的DMEM/F12代替NSC,mNSS评估时间和方法同NSC组。4w后NSC组取5只大鼠脑组织行免疫组化法染色检测BrdU表达。结果 NSC组大鼠在移植后第7d、14d、21d和24d,其mNSS评分与DMEM/F12组相比,均有显著性差异。对脑组织行BrdU免疫荧光染色,发现移植后第4w脑损伤灶及周围脑组织中有BrdU阳性细胞的表达。结论经枕大池移植后,NSC可在大鼠脑组织内存活、增殖,并能促进脑损伤大鼠神经功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,并探讨其可能的机制。方法经体外培养并纯化BMSCs,移植前以10 mg/L的BrdU进行标记。线栓法制作大鼠MCAO模型,随机分为移植A组、B组及对照C组。在模型建立后7 d,通过尾静脉分别将3×10~6个BMSCs、1×10~6个BMSCs移植入A、B组大鼠体内,C组不作处理。于移植前、后分别进行改良神经损伤严重程度评分(mNSS)及Morris水迷宫测试,并取大鼠脑组织行免疫组织化学染色。结果移植A组与移植B组、C组比较,行为学恢复更为明显,(P0.01);B、C两组相比无显著性差异(P0.05);移植A组大鼠学习和记忆能力较C组明显改善(P0.05)。A、B组大鼠在脑损伤中心及周围区,可见Brdu单染阳性细胞及Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF双染阳性细胞。结论 BMSCs经尾静脉移植至MCAO大鼠体内后,可在大鼠体内存活、分化,并促进大鼠伸进功能恢复。疗效与移植细胞数量相关。     

自体骨髓内皮祖细胞移植治疗动脉粥样硬化大鼠急性脑缺血的实验研究

目的 探讨自体骨髓内皮祖细胞移植治疗动脉粥样硬化大鼠急性局灶性脑缺血的有效性.方法 高脂膳食制备20只动脉粥样硬化大鼠模型,采集骨髓,分离血管内皮祖细胞(EPCs)并扩增培养,检测其表面标记物的表达;第7天采用线栓法制作急性局灶性脑缺血模型,造模后3 h进行移植,其中实验组经颈静脉自体移植BrdU标记的EPCs,对照组给予等量的PBS.急性脑缺血术后6 h和第1、3、7、10、14天通过神经功能缺损评分(mNSS)量表行行为学评价,免疫组化染色观察BrdU标记的EPCs在缺血脑组织的分布和血管密度.结果体外培养大鼠骨髓来源的EPCs,细胞数目可达到5×106;CD34免疫荧光和FLK-1免疫组化鉴定呈阳性,并能特异性吸附FITC-UEA和内吞DIL-Ac-LDL.第14天实验组mNSS得分为6.13±0.30.对照组为8.50±0.46,比较差异具有统计学意义(P<0.05),实验组神经功能的恢复优于对照组.第28天实验组脑缺血区和血管壁可见BrdU标记的EPCs,而对照组则为阴性.免疫组化染色显示实验组大鼠缺血脑组织血管数为16.87±5.52,对照组大鼠缺血脑组织血管数为12.76±4.94,比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论 从活体大鼠骨髓中分离的EPCs通过自体移植后可以进入脑缺血区并长期存活,其能够促进神经功能恢复,这可能与血管再生有关.     

骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的动态影响

目的探讨骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。32只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血骨髓基质细胞移植组和缺血骨髓基质细胞源神经干细胞移植组。分别在移植后7d和14d行脑灌注固定取材,应用免疫组化染色及原位细胞凋亡检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达及凋亡细胞数。结果缺血移植组各时点的凋亡细胞数均少于缺血对照组(P<0.01),缺血移植14d组凋亡细胞数明显少于缺血移植7d组(P<0.01),骨髓基质细胞源神经干细胞移植组凋亡细胞明显少于骨髓基质细胞移植组(P<0.05)。缺血移植组Bcl-2表达显著高于缺血对照组(P<0.01)。缺血移植组Bax蛋白表达明显低于缺血对照组(P<0.01)。结论骨髓基质细胞源神经干细胞可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

骨髓基质细胞静脉移植治疗大鼠短暂性局灶性脑缺血

目的探讨骨髓基质细胞静脉移植治疗大鼠短暂性局灶性脑缺血的可行性及其机制。方法将大鼠骨髓基质细胞在体外纯化、扩增并经BrdU标记后,经尾静脉移植到局灶性脑缺血大鼠体内,通过神经缺损评分观察移植后大鼠神经行为学改善情况,通过组织学方法观察移植到脑内的骨髓基质细胞表达脑源性神经营养因子、缺血灶周围细胞凋亡及脑微血管密度的变化。结果骨髓基质细胞移植组大鼠的神经缺损评分显著低于对照组(P<0.05);移植到脑内的骨髓基质细胞主要选择性分布于缺血灶周围区域并表达BDNF;骨髓基质细胞移植组大鼠梗死灶周围的凋亡细胞明显少于对照组(P<0.01)、微血管密度显著高于对照组(P<0.001)。结论经静脉注射移植骨髓基质细胞能够明显促进局灶性脑缺血大鼠的神经行为功能恢复;抗凋亡及促微血管增生可能是骨髓基质细胞移植治疗局灶性脑缺血的机制之一。     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景：脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。 目的：观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。 方法：体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组：正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型,又分为缺血2 h再灌注7,14,21,28 d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24 h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109 L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。 结果与结论：免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2 h再灌注7,14,21,28 d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义(P < 0.05~0.01)。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨胎鼠皮质培养的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的可行性及疗效。方法取孕龄15d Sprague-Dawley(SD)胎鼠皮质细胞培养为神经干细胞;用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型;将24只健康SD大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血移植组,在移植后2周、4周依据Garcia的18分评分法对各组大鼠的神经功能进行评分;行脑灌注固定取材,免疫组化染色观察移植后神经干细胞的分化、迁移和整合情况。结果用胎鼠皮质培养的细胞nestin表达阳性;缺血移植组大鼠的神经功能评分明显高于缺血对照组(P<0.05);缺血移植组免疫组织化学染色能够检测到存活的BrdU阳性细胞,移植后4周时可见移植细胞向周围迁移、分化、参与血管形成,并可见梗死区边缘微血管明显增生;缺血移植组大鼠脑GFAP阳性细胞数较缺血对照组明显增多(P<0.05)。结论分离、培养胎鼠皮质细胞Nestin表达阳性,即是大鼠的神经干细胞;移植体外培养的神经干细胞能在脑缺血大鼠脑内存活、迁移、分化,并且对脑梗死大鼠的神经功能修复起到了积极作用。     

骨髓间充质干细胞移植对永久性大脑中动脉阻塞大鼠生长相关蛋白43及脑梗死体积的影响

背景：大量实验表明骨髓间充质干细胞植入缺血大鼠脑内能够通过血脑屏障在脑中成活并迁移,可部分转变为神经元,并能促进多种神经营养因子分泌,明显改善神经功能缺损,较神经保护剂具有更长的治疗时间窗。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠永久性大脑中动脉阻塞后内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达及脑梗死体积的影响。 方法：将成年SD大鼠按随机数字表法分为模型对照组、假手术组、干细胞移植组。另取成年SD大鼠4只制备骨髓间充质干细胞,并以5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记。假手术组分离结扎右侧颈总动脉;其余大鼠制备永久性右侧大脑中动脉缺血模型,造模后,干细胞移植组移植骨髓间充质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液。于移植前、移植后7,14,21,28 d进行神经功能缺损评分,应用免疫组织化学法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43表达。 结果与结论：干细胞移植组移植后7 d在梗死灶能检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞, 移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失;移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性显著高于模型对照组(P < 0.05)。假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间推移,模型对照组和干细胞移植组神经功能评分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组神经功能评分明显低于模型对照组(P < 0.05)。与模型对照组相比,干细胞移植组脑梗死体积均显著减小(P < 0.05)。结果显示,骨髓间充质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,并显著减小脑梗死体积。     

骨髓基质细胞移植治疗大鼠实验性脑梗死的疗效分析及组织病理学观察

目的 观察大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠脑内移植骨髓基质细胞fBMSCs)的治疗作用,分析植入梗死灶不同区域的BMSCs的存活、迁移情况以及植入细胞的行为与脑内微环境中GFAP阳性细胞的形态关系.方法 75只成年SD大鼠采用随机数字表法分为MCAO组(n=50)和BMSCs移植组(n=25),所有动物均采用线栓法制作MCAO 1 h模型,24 h后BMSCs移植组脑内注射BrdU标记的同种异体BMSCs(2x106个),MCAO组注射等量PBS.MCAO前及MCAO后第1(移植前)、3、5、7、10、14天应用加速转轮试验和贴纸去除试验检测神经功能缺损情况;第14天处死动物,取脑组织切片应用HE染色观察两组的缺血病灶范围,行BrdU和GFAP免疫组化染色观察BMSCs在不同区域和不同胶质细胞环境下的存活和迁移情况.结果 BMSCs移植组MCAO后7 d加速转轮试验结果优于MCAO组,差异有统计学意义(P＜0.05);组织学观察发现植入缺血半暗带区的细胞存活数量最多,且向病变方向放射状迁移,植入缺血病灶核心的细胞甚少存活,且无迁移现象.结论 BMSCs脑内移植可改善MCAO后大鼠神经运动功能;活化的星形胶质细胞构成适合植入细胞存活、迁移的环境,而胶质瘢痕阻碍了细胞的迁移.