成骨不全家系一个新的Ⅰ型胶原α1链蛋白基因突变

目的 对Ⅰ型胶原α1链蛋白基因（COL1A1基因）进行测序研究，旨在寻找已知或未知的COL1A1基因突变位点，探讨我国成骨不全的发病机制。方法 研究一常染色体显性遗传成骨不全家系的临床特征，设计引物对家系中患者和正常人的COL1A1基因外显子进行扩增和测序分析，同时对群体中无血缘关系的50名健康对照者进行限制性内切酶分析。结果 发现家系中成骨不全患者COL1A1基因的第3470位点的碱基G→A的突变，导致G1157D，而在家系内非患者及正常对照者中均无发现。结论 COL1A1基因突变也是中国人群中成骨不全致病原因之一，现发现的突变属成骨不全一个新的致病基因突变。甘氨酸转变成天冬氨酸的这种突变对成骨不全表型具有重要的影响。     

一例Ⅰ型成骨不全家系的基因定位及突变检测

目的 对国内1例成骨不全(OI)家系进行基因突变及突变效应分析,为研究中国人群的成骨不全基因突变特点提供线索.方法 对成骨不全Ⅰ型胶原基因COL1A1和COL1A2所在的17号染色体和7号染色体分别进行连锁分析,对致病基因做初步判断,然后用聚合酶链反应扩增致病基因外显子,并测序检出基因突变.结果 该家系为COL1A1基因突变,所有患者在该基因的第8个内含子剪切受体位点处为AG→GG(IVS8-2A＞G)突变.结论 对比COL1A1基因突变数据库,该突变为一新发现突变.     

一例Ⅰ型成骨不全家系的基因定位及突变检测

目的对国内1例成骨不全(OI)家系进行基因突变及突变效应分析,为研究中国人群的成骨不全基因突变特点提供线索。方法对成骨不全Ⅰ型胶原基因COL1A1和COL1A2所在的17号染色体和7号染色体分别进行连锁分析,对致病基因做初步判断,然后用聚合酶链反应扩增致病基因外显子,并测序检出基因突变。结果该家系为COL1A1基因突变,所有患者在该基因的第8个内含子剪切受体位点处为AG→GG(IVS8-2A>G)突变。结论对比COL1A1基因突变数据库,该突变为一新发现突变。     

成骨不全一家系1型胶原α1链基因新突变

目的 检测一个非近亲婚配的成骨不全家系中5例患者的1型胶原α1链(COL1A1)基因突变位点.方法 收集一个成骨不全家系的临床资料,每例患者采用双能X线吸收仪检测其L1～k4股骨颈和全髋部位的骨密度(BMD),并采用聚合酶链反应及直接测序法对家系内成员及50名对照者进行COL1A1基因突变位点检测.结果 根据临床表现和放射学资料,该家庭中5例患者被诊断为Ⅰ型成骨不全显性遗传.该家系中成骨不全患者均存在COL1A1基因的第28外显子的两个碱基(AG)缺失造成的突变(P.Gly632x),均为杂合突变,导致632Gly之后的氨基酸编码提前终止,而在家系内正常个体及其他正常对照者中均未发现该突变.除先证者姨妈和表哥的L1～L4 BMD低于同龄正常人外,其他患者的BMD基本与同龄正常人相似.结论 本研究首次发现了位于COL1A1基因第28外显子的新突变位点可导致Ⅰ型成骨不全,为进一步探讨COL1A1基因型和成骨不全表型的关系提供了依据.     

成骨不全症家系基因突变位点的检测

目的检测一I型成骨不全症家系中4例患者的基因突变位点。方法收集该家系患者外周血标本及健康人对照外周血标本,采用聚合酶链式反应、直接测序对COL1A1基因突变位点检测。结果该家系中成骨不全患者均存在COL1A1基因第23号外显子上一处G-C突变,在家系内非患者及正常对照者均未发现该突变。结论本研究为I型成骨不全的突变位点提供了新的证据,为进一步讨论COL1A1基因型和成骨不全临床分型之间的关系提供了研究基础。     

成骨不全家系Ⅰ型胶原COL1A1基因一个新RNA剪接突变位点的发现

目的:成骨不全(OI)又称脆骨病,是一种少见的遗传性骨病,临床表现主要包括骨密度降低、骨脆病增加、蓝巩膜、牙本质发育不全等,发病率约为1 : 10000报告1个成骨不全(OI)家系并检测Ⅰ型胶原基因(COL1A1和COL1A2)的突变位点.方法:家系患者均具有易骨折和蓝巩膜等特点,诊断为OI.提取外周血基因组DNA,对COL1A1和COL1A2基因的所有启动子、外显子以及外显子-内含子进行DNA测序.基因突变位点的杂合状态通过序列特异引物PCR(PCR-SSP)进行证实.结果:DNA测序显示, 2例OI患者COL1A1基因内含子27的5′端RNA剪接位点发生突变(c.1875+1G>A, 即 IVS 27+1 G>A),该突变与OI临床诊断一致.而家系中9名正常成员和50名健康对照者均未检测到该剪接位点突变.c.1875+1G>A在文献及胶原基因突变数据库均未见,为 OI患者COL1A1基因的新突变位点,PCR-SSP证实了内含子27的杂合性.结论:本研究在一OI中国家系发现了致病基因COL1A1新的RNA剪接位点突变(c.1875+1G>A),详细的分子及临床特征对认识OI患者遗传和表型异质性、进一步研究OI基因型-表型关系有作用.     

老年男性骨密度与Ⅰ型胶原α1链及α2链基因多态性的研究

[目的]探讨Ⅰ型胶原α1链(Collagen typeⅠ alpha 1,COL1A1)及α2链(COL1A2)基因型与老年男性骨密度(BMD)相互关系.[方法]选取年龄≥65岁男性个体193例,采用双能X线吸收法(DEXA)测定其全身、腰椎2～4(L2～4)、股骨颈(Neck)、Ward'三角和大转子区的BMD值,并分别采用AS-PCR及PCR-RFLP方法检测外周血白细胞基因组COL1A1及COL1A2基因型.[结果]193例受试对象中,COL1A1基因型均为SS型;COL1A2基因型分别为EE 81例、Ee83例、ee29例.[结论]受试人群Ⅰ型胶原α1链Sp1结合位点不存在G→T突变,骨密度与COL1A1未见基因多态性无相关性;对于COL1A2基因而言,携带EE基因型的老年男性个体具有较低的骨密度值.     

风湿性心脏瓣膜病合并心房颤动中胶原蛋白表达与分布

目的 探讨胶原纤维在风湿性心脏瓣膜病心房颤动(房颤)患者中的异常表达以及与房颤发生的相关性.方法 33例风湿性心脏病接受换瓣患者分为窦性心律组与房颤组.于手术中获取右心耳组织.采用转录组学进行差异表达基因的功能分析;RT-PCR检测Ⅰ~Ⅳ型胶原纤维RNA在右心房组织中的表达;免疫组化观察心肌组织各型胶原纤维的表达与分布.结果 与窦性心律组相比,房颤组左心房内径明显扩大.转录组学分析显示COL1A2、COL2A1、COL3A1以及COL4A3与COL5A2、COL6A3、COL11A1等胶原纤维存在相互关联之外,与多种细胞因子也存在相互作用;RT-PCR结果示COL1A2、COL2A1、COL3A1和COL4A3均在房颤患者右心房组织中上调表达,其中COL3A1、COL4A3上调表达显著(P<0.05).免疫组化结果显示Ⅰ型胶原纤维分布在血管内皮细胞及血管基底膜;Ⅱ型胶原纤维分布在心肌细胞肌节;Ⅲ型胶原纤维分布在间皮细胞及心肌细胞浆;Ⅳ型胶原纤维分布在心肌细胞外膜.结论 心房组织中COL3A1与COL4A3表达异常,与多种细胞因子相互作用引发房颤的发生和发展.     

广州地区部分汉族人群骨密度与Ⅰ型胶原α1及α2链基因多态性相关性

目的探讨Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)及α2链(COL1A2)基因型与广州地区部分汉族人群骨密度相互关系.方法选取成年个体628例[年龄20～79岁,平均(53.4±15.9)岁],双能X线吸收法测定其全身、腰椎2～4(L2～4)、股骨颈、Ward氏三角和大转子区等部位的骨密度值,采用PCR-RFLP方法检测外周血白细胞基因组COL1A1及COL1A2基因型.结果628例受试对象中,未能观察到Ⅰ型胶原α1链Sp1结合位点G→T突变,COL1A1基因型均为SS型;COL1A2基因型分别为EE型311例,占49.5%;Ee型252例,40.1%;ee型65例,10.4%.基因及基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律.不同基因型个体的骨密度值没有显著差异.结论在汉族人群中,不存在COLIA1Sp1结合位点的多态性,COLIA2EcoRI位点多态性与骨密度的关系不密切,尚不能作为筛查广州地区骨质疏松症高危人群的候选基因.     

RNAi对人类皮肤成纤维细胞COL1A1及COL3A1表达的影响

目的 研究RNA干扰(RNAi)技术对人类皮肤成纤维细胞(HSF)COL1A1及COL3A1表达的影响.Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是构成皮肤结缔组织的主要成份,其异常是造成真皮结缔组织以及纤维增生性疾病病理变化的主要因素.RNAi技术可有效抑制特定基因的表达.方法 利用小干扰RNA(siRNA)表达框(SEC)快速筛选有效干扰序列,再将有效SEC的siRNA片段连接入表达载体并转染HSFs,获得稳定抑制效果.结果 经过筛选的有效SEC可特异性抑制HSFs中COL1A1和COL3A1的表达(分别至野生株的5.00%和6.48%),载体介导的有效干扰序列可稳定抑制HSFs中COL1A1和COL3A1的表达,抑制效果达30 d(分别至阴性对照的25.21%和22.12%).结论 SEC和载体介导的RNAi均可有效并且特异性抑制COL1A1和COL3A1在HSFs中的表达.     

转化生长因子β_2对人视网膜色素上皮细胞Ⅰ型胶原蛋白表达和Smad 2/3磷酸化水平的影响

目的:探讨转化生长因子β2(TGF-β2)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)表达及细胞内Smad 2/3蛋白磷酸化水平的影响。方法:传代培养人RPE-19细胞,采用不同浓度的TGF-β2(0.1,1,5,10μg/L)分别刺激RPE细胞6,12,24h。RT-PCR测定各个不同浓度、时间干预的RPE细胞COLⅠA2mRNA的表达,Western blot检测COLⅠ蛋白水平表达。选择干预效果最好的TGF-β2浓度刺激RPE细胞,检测各时间点RPE细胞内Smad 2/3蛋白磷酸化水平的变化。结果:不同浓度TGF-β2可刺激RPE细胞COLⅠA2mRNA及COLⅠ蛋白表达上调,其中10μg/L最明显,作用24h达到高峰,为对照组的2.74倍。各组间差异有统计学意义(P<0.05)。在浓度为10μg/L TGF-β2刺激24h后,细胞内Smad 2/3蛋白的磷酸化水平明显升高,是对照组的2.33倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β2能以剂量和时间依赖的方式上调COLⅠA2mRNA及COLⅠ蛋白的表达,这种表达可能与TGF-β/smad通路中Smad 2/3蛋白的磷酸化水平相关。     

醛固酮诱导人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ表达的研究

目的：探讨Rho激酶对醛固酮（ALD）诱导的人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ（COL Ⅰ、Ⅲ）表达的影响。方法将人肾小管上皮细胞 HK‐2培养于含15％胎牛血清（FBS）的RPMI‐1640培养液中,ALD受体拮抗剂依普利酮（10μmol／L）和Rho激酶抑制剂Y27632（1μmol／L）预处理细胞30 min后,100 nmol／L ALD作用 HK‐2细胞24 h ,实时定量 PCR法检测各组细胞中COLⅠ、Ⅲ mRNA的表达,酶联免疫吸附试验测定培养上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶蛋白表达水平。结果 ALD可上调HK‐2细胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表达,并增加培养上清液中Rho激酶、COL Ⅰ、Ⅲ蛋白表达水平,Rho激酶抑制剂Y27632及ALD受体拮抗剂依普利酮可拮抗上述效应。结论 ALD可活化 HK‐2细胞Rho激酶信号传导通路,并通过Rho激酶诱导 HK‐2细胞COL Ⅰ、Ⅲ的表达而加速肾小管间质纤维化的进展。     

Ⅱ型胶原纤维α1基因（COL2A1）在视网膜脱离中的作用的研究进展

COL2A1基因编码Ⅱ型胶原蛋白的α1链、Ⅱ型胶原蛋白是正常玻璃体结构的重要组成部分。COL2A1基因突变可导致包括视网膜脱离在内的多系统异常。本文对COL2A1基因突变与视网膜脱离之间的关系进行简要综述,回顾以往COL2A1基因突变与视网膜脱离的分子遗传学研究结果,探讨视网膜脱离的分子遗传学途径。     

细胞直接共培养模型在大鼠肺成纤维细胞转分化中的应用

目的:探讨细胞直接共培养模型在大鼠肺成纤维细胞转分化研究中的应用价值。方法:分离SD大鼠肺巨噬细胞和成纤维细胞,采用ThinCertTM进行共培养,并分为4组:对照组加入无SiO2粉尘的培养基,SiO2低、中、高剂量处理组分别加入终质量浓度为25、50和100mg/L的SiO2粉尘悬液,培养24h后,收集成纤维细胞和培养上清,分别采用real-time PCR检测成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)及Ⅲ型胶原(COLⅢ)的mRNA水平,ELISA法测定培养上清中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ蛋白。结果:SiO2处理组的α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA和蛋白的表达水平明显高于对照组,且随SiO2质量浓度的升高,α-SMA、COLⅠ和COLⅢmRNA和蛋白的表达水平有升高的趋势(P<0.05)。结论:细胞直接共培养模型可用于大鼠肺成纤维细胞转分化的研究。     

外源性Ⅰ型胶原对人胚骨膜成骨细胞生物学特性的影响

目的　研究 型胶原对人胚骨膜来源成骨细胞生物学特性的影响 ,为 型胶原在组织工程人工骨中的应用提供依据。方法　在不同浓度 型胶原涂层上培养成骨细胞 ,用细胞计数法研究成骨细胞粘附情况 ,3 H- Td R掺入实验观察成骨细胞增殖能力 ,通过检测成骨细胞胶原、骨钙素和碱性磷酸酶的合成情况 ,以不涂层 型胶原为对照组 ,比较骨膜来源成骨细胞成骨能力的改变。结果　 型胶原对成骨细胞发挥以下作用 :1增加粘附细胞数量 ,且在 2 5 μg/ m l浓度达最大效应 ;2减弱成骨细胞增殖能力 ,且以 12 .5 μg/ ml以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 ) ;3轻度减弱成骨细胞 型胶原合成能力 ,以 2 5 μg/ ml以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 ) ;4增加骨钙素合成 ,以6 .2 5 μg/ m l以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 ) ,2 5 μg/ m l浓度达最大效应 ;5增加成骨细胞碱性磷酸酶活性 ,以 12 .5 μg/ml以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 )。结论　 型胶原能促进成骨细胞的粘附与分化 ;支架材料上复合 型胶原涂层可增强成骨细胞的成骨能力 ; 型胶原最佳复合浓度为 2 5 μg/ ml     

高糖环境及雷帕霉素干预对肾小球足细胞Ⅳ型胶原和MMP-9表达的影响

目的探讨高糖培养环境及雷帕霉素干预对肾小球足细胞Ⅳ型胶原和基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响。方法体外培养的小鼠肾小球足细胞分为空白对照组、高渗对照组、高糖组和高糖＋雷帕霉素干预组。Real-time PCR和Western blotting检测各组肾小球足细胞Ⅳ型胶原α3链（COL4A3）、α5链（COL4A5）mRNA及MMP-9mRNA和蛋白的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅳ型胶原的含量。结果与对照组比较,高糖组足细胞COL4A3、COL4A5mRNA表达及培养上清液中Ⅳ型胶原含量均升高（P〈0.05）,而足细胞MMP-9mRNA和蛋白表达均降低（P〈0.05）。与高糖组比较,雷帕霉素干预组足细胞COL4A3、COL4A5mRNA表达及培养上清液中Ⅳ型胶原含量均降低（P〈0.05）,足细胞MMP-9mRNA和蛋白表达均升高（P〈0.05）。结论雷帕霉素对高糖环境中足细胞Ⅳ型胶原和MMP-9表达异常具有逆转作用。     

IL-1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制

目的研究白细胞介素1β(IL-1β)对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白的作用及机制,以探讨IL-1β对硬膜外瘢痕形成的影响。方法将NIH3T3细胞随机分为IL-1β组I、L-1β+SB202190(p38 MAPK特异性阻断剂)组和对照组,各组经无血清培养20 h后,IL-1β组加入10μg/L的IL-1β,IL-1β+SB202190组用10μmol/L的SB202190预作用1 h后加入10μg/L的IL-1β,对照组直接加体积分数0.02的血清。各组培养24 h后收集细胞,采用RT-PCR法检测Ⅰ型胶原α2基因(COL1A2)mRNA的表达,Western blotting法检测COL1A2蛋白的表达。结果 IL-1β组COL1A2 mRNA和COL1A2蛋白表达均明显低于IL-1β+SB202190组和对照组,差异有显著性(F=55.67、251.01,q=11.88~28.79,P<0.01);IL-1β+SB202190组低于对照组,但差异无显著性(q=1.88、2.93,P>0.05)。结论 IL-1β可能通过抑制NIH3T3细胞COL1A2的合成而抑制硬膜外瘢痕的形成,p38信号通路在IL-1β抑制瘢痕形成过程中起到重要的作用。     

Ⅰ型胶原基因启动子区-1997G/T位点多态性和成都地区汉族绝经后妇女骨密度的相关性研究

目的 研究Ⅰ型胶原α_1链(COLⅠA1)基因启动子区-1997G/T位点多态性与成都地区汉族绝经后妇女腰椎骨密度的相互关系.方法 根据双能X线吸收法测定第2～4腰椎(L_(2～4))部位的骨密度值的结果 ,纳入受试者318例,均为成都地区汉族绝经后妇女,其中骨质疏松症组212例,正常对照组106例;抽取受试者外周静脉血2 mL,提取白细胞基因组DNA;采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的 基因所在的DNA片段;应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法 检测外周血白细胞基因组COL1A1基因启动子区-1997G/T位点多态性.结果 骨质疏松症组中COLⅠA1基因启动子区-1997G/T位点GG、GT、TT基因型分别有82例、99例和31例,对照组中GG、GT、TT基因型分别有51例、45例和10例;骨质疏松症组的COLⅠA1基因启动子区-1997G/T位点等位基因T的频率较正常对照组高(P＜0.05);对骨质疏松症组按基因型分组进一步分析发现,TT纯合子组个体的腰椎骨密度比GG纯合子组和GT杂合子组低(P＜0.05).结论 COLⅠA1基因启动子区-1997G/T位点多态性与成都地区汉族绝经后妇女腰椎骨密度相关,携带TT基因型的个体更易导致低骨矿密度和患骨质疏松症.