成骨不全家系Ⅰ型胶原COL1A1基因一个新RNA剪接突变位点的发现

目的:成骨不全(OI)又称脆骨病,是一种少见的遗传性骨病,临床表现主要包括骨密度降低、骨脆病增加、蓝巩膜、牙本质发育不全等,发病率约为1 : 10000报告1个成骨不全(OI)家系并检测Ⅰ型胶原基因(COL1A1和COL1A2)的突变位点.方法:家系患者均具有易骨折和蓝巩膜等特点,诊断为OI.提取外周血基因组DNA,对COL1A1和COL1A2基因的所有启动子、外显子以及外显子-内含子进行DNA测序.基因突变位点的杂合状态通过序列特异引物PCR(PCR-SSP)进行证实.结果:DNA测序显示, 2例OI患者COL1A1基因内含子27的5′端RNA剪接位点发生突变(c.1875+1G>A, 即 IVS 27+1 G>A),该突变与OI临床诊断一致.而家系中9名正常成员和50名健康对照者均未检测到该剪接位点突变.c.1875+1G>A在文献及胶原基因突变数据库均未见,为 OI患者COL1A1基因的新突变位点,PCR-SSP证实了内含子27的杂合性.结论:本研究在一OI中国家系发现了致病基因COL1A1新的RNA剪接位点突变(c.1875+1G>A),详细的分子及临床特征对认识OI患者遗传和表型异质性、进一步研究OI基因型-表型关系有作用.     

绝经后妇女骨密度与Ⅰ型胶原α1链及α2链基因多态性相关性研究

目的探讨人Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)及α2链(COL1A2)基因型与绝经后妇女骨密度相互关系.方法选取年龄≥42岁绝经后妇女(自然绝经≥2年)231例,采用双能X线吸收法(DEXA)测定其全身、腰椎2～4(L2～4)、股骨颈(Neck)、Ward'三角和大转子区等部位的骨密度(BMD)值,并采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测外周血白细胞基因组Ⅰ型胶原α1链及α2链基因型.结果231例受试对象中,Ⅰ型胶原α1链PCR扩增产物未发现ACCB7I酶切位点,Sp Ⅰ结合位点不存在G→T突变,Ⅰ型胶原α1链基因型均为SS型;Ⅰ型胶原α2链基因型分别为EE型113例,Ee型91例,ee型27例(分别占48.9%、39.4%、11.7%),等位基因频率E和e各为68.6%、31.4%.基因型分布符合Hardy-weinberg定律.携带EE基因型的个体比Ee基因型和ee基因型个体的骨密度值为低,但只在腰椎侧位(L2-L4)、股骨颈(Neck)、大转子(Troch)、Ward's三角(Ward's)等部位的骨密度值EE基因型比Ee基因型携带者明显降低(P＜0.05).结论广州地区绝经后妇女COL1A1 Sp Ⅰ结合位点不存在G→T突变.COL1A2基因EE型个体较Ee基因型及ee基因个体的骨密度值低,绝经后妇女骨密度与COL1A2基因多态性存在一定相关性.     

成骨不全家系一个新的Ⅰ型胶原α1链蛋白基因突变

目的 对Ⅰ型胶原α1链蛋白基因（COL1A1基因）进行测序研究，旨在寻找已知或未知的COL1A1基因突变位点，探讨我国成骨不全的发病机制。方法 研究一常染色体显性遗传成骨不全家系的临床特征，设计引物对家系中患者和正常人的COL1A1基因外显子进行扩增和测序分析，同时对群体中无血缘关系的50名健康对照者进行限制性内切酶分析。结果 发现家系中成骨不全患者COL1A1基因的第3470位点的碱基G→A的突变，导致G1157D，而在家系内非患者及正常对照者中均无发现。结论 COL1A1基因突变也是中国人群中成骨不全致病原因之一，现发现的突变属成骨不全一个新的致病基因突变。甘氨酸转变成天冬氨酸的这种突变对成骨不全表型具有重要的影响。     

绝经后妇女骨密度与Ⅰ型胶原理α1链及α2链基因多态性相关性研究

目的探讨人Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)及α2链(COL1A2)基因型与绝经后妇女骨密度相互关系。方法选取年龄≥42岁绝经后妇女(自然绝经≥2年)231例,采用双能X线吸收法(DEXA)测定其全身、腰椎2～4(L2～4)、股骨颈(Neck)、Ward?三角和大转子区等部位的骨密度(BMD)值,并采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测外周血白细胞基因组Ⅰ型胶原α1链及α2链基因型。结果231例受试对象中,Ⅰ型胶原α1链PCR扩增产物未发现ACCB7I酶切位点,SpⅠ结合位点不存在G→T突变,Ⅰ型胶原α1链基因型均为SS型;Ⅰ型胶原α2链基因型分别为EE型113例,Ee型91例,ee型27例(分别占48.9%、39.4%、11.7%),等位基因频率E和e各为68.6%、31.4%。基因型分布符合Hardy-weinberg定律。携带EE基因型的个体比Ee基因型和ee基因型个体的骨密度值为低,但只在腰椎侧位(L2-L4)、股骨颈(Neck)、大转子(Troch)、Ward?s三角(Ward?s)等部位的骨密度值EE基因型比Ee基因型携带者明显降低(P<0.05)。结论广州地区绝经后妇女COL1A1SpⅠ结合位点不存在G→T突变。COL1A2基因EE型个体较Ee基因型及ee基因个体的骨密度值低,绝经后妇女骨密度与COL1A2基因多态性存在一定相关性。     

一例Ⅰ型成骨不全家系的基因定位及突变检测

目的 对国内1例成骨不全(OI)家系进行基因突变及突变效应分析,为研究中国人群的成骨不全基因突变特点提供线索.方法 对成骨不全Ⅰ型胶原基因COL1A1和COL1A2所在的17号染色体和7号染色体分别进行连锁分析,对致病基因做初步判断,然后用聚合酶链反应扩增致病基因外显子,并测序检出基因突变.结果 该家系为COL1A1基因突变,所有患者在该基因的第8个内含子剪切受体位点处为AG→GG(IVS8-2A＞G)突变.结论 对比COL1A1基因突变数据库,该突变为一新发现突变.     

一例Ⅰ型成骨不全家系的基因定位及突变检测

目的对国内1例成骨不全(OI)家系进行基因突变及突变效应分析,为研究中国人群的成骨不全基因突变特点提供线索。方法对成骨不全Ⅰ型胶原基因COL1A1和COL1A2所在的17号染色体和7号染色体分别进行连锁分析,对致病基因做初步判断,然后用聚合酶链反应扩增致病基因外显子,并测序检出基因突变。结果该家系为COL1A1基因突变,所有患者在该基因的第8个内含子剪切受体位点处为AG→GG(IVS8-2A>G)突变。结论对比COL1A1基因突变数据库,该突变为一新发现突变。     

Ⅰ型胶原α1链Sp1位点基因多态性与骨质疏松症的关系

目的探讨Ⅰ型胶原α1链Sp1位点基因多态性与骨质疏松症的关系。方法采用PCR-RFLP技术分析76例确诊为骨质疏松症的绝经后妇女COL1A1 Sp1位点基因型,并分析基因型与骨密度和骨转换指标间的关系。结果"s"等位基因在健康对照组中的频率为3·3%,在原发性骨质疏松组为10%,而在2型糖尿病合并骨质疏松组为7·6%,但组间分布差异无显著性(P>0·05)。SS型较Ss型在腰椎有较高的骨密度(P=0·04),而不同基因型间骨转换指标无明显差异结论广州地区汉族人群中等位基因可能与低骨密度相关。     

老年男性骨密度与Ⅰ型胶原α1链及α2链基因多态性的研究

[目的]探讨Ⅰ型胶原α1链(Collagen typeⅠ alpha 1,COL1A1)及α2链(COL1A2)基因型与老年男性骨密度(BMD)相互关系.[方法]选取年龄≥65岁男性个体193例,采用双能X线吸收法(DEXA)测定其全身、腰椎2～4(L2～4)、股骨颈(Neck)、Ward'三角和大转子区的BMD值,并分别采用AS-PCR及PCR-RFLP方法检测外周血白细胞基因组COL1A1及COL1A2基因型.[结果]193例受试对象中,COL1A1基因型均为SS型;COL1A2基因型分别为EE 81例、Ee83例、ee29例.[结论]受试人群Ⅰ型胶原α1链Sp1结合位点不存在G→T突变,骨密度与COL1A1未见基因多态性无相关性;对于COL1A2基因而言,携带EE基因型的老年男性个体具有较低的骨密度值.     

胃癌患者血清Ⅺ型胶原α1链的表达及临床意义

目的: 检测胃癌患者血清Ⅺ型胶原α1链（COL11A1）的表达并探讨其临床意义。方法: 实时荧光定量PCR法检测COL11A1基因在健康体检者（n=25）、浅表性胃炎患者(n=25)和胃癌患者(n=50)血清中的表达水平,分析其与临床病理参数的相关性,并采用ROC曲线分析其诊断效能。结果： 胃癌患者术前血清COL11A1表达（5.196±1.417）明显高于健康体检者（1.398±0.182,t=2.659,P0.05）。胃癌患者血清COL11A1的ROC曲线下面积为0.811,95%可信区间（CI）为0.680~0.942,当临界值为1.583时,敏感性为75%,特异性为76.5%。 结论： 胃癌患者血清COL11A1基因高表达,且与肿瘤浸润深度和TNM分期密切相关,有望成为新的临床诊断指标。     

反义α_1(Ⅰ)型前胶原基因片段真核细胞表达质粒的构建与鉴定

为利用反义RNA下调成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达，根据α1（Ⅰ）前胶原基因的核苷酸序列，我们自行设计了6条寡核苷酸引物，从正常人外周血全基因组DNA中分别扩增α1（Ⅰ）前胶原基因的转录起始区域及第Ⅰ，Ⅱ外显子区域3个基因片段。片段长度分别为229、166、195hP。为了后续进行定向克隆，在引物上分别引入了限制性内切酶酶切位点，并附加酶切保护碱基。由于1、刀、皿、V、力型多种胶原由不间断的重复的氨基酸序列（Gly－X－Y）n组成，其中X多为脯氨酸，而Y多为羟瞄氨酸，放各种胶原基因的结构极为相似，而且基因中GC含量很高（Gl…     

广州地区部分汉族人群骨密度与Ⅰ型胶原α1及α2链基因多态性相关性

目的探讨Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)及α2链(COL1A2)基因型与广州地区部分汉族人群骨密度相互关系.方法选取成年个体628例[年龄20～79岁,平均(53.4±15.9)岁],双能X线吸收法测定其全身、腰椎2～4(L2～4)、股骨颈、Ward氏三角和大转子区等部位的骨密度值,采用PCR-RFLP方法检测外周血白细胞基因组COL1A1及COL1A2基因型.结果628例受试对象中,未能观察到Ⅰ型胶原α1链Sp1结合位点G→T突变,COL1A1基因型均为SS型;COL1A2基因型分别为EE型311例,占49.5%;Ee型252例,40.1%;ee型65例,10.4%.基因及基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律.不同基因型个体的骨密度值没有显著差异.结论在汉族人群中,不存在COLIA1Sp1结合位点的多态性,COLIA2EcoRI位点多态性与骨密度的关系不密切,尚不能作为筛查广州地区骨质疏松症高危人群的候选基因.     

I型胶原α1链Sp1位点基因多态性与骨质疏松症

目的 探讨I型胶原α1链Sp1位点基因多态性与骨质疏松症的关系。方法 采用PCR-RFLP技术分析76例确诊为骨质疏松症的绝经后妇女COL1A1 Sp1位点基因型,并分析基因型与骨密度和骨转换指标间的关系。结果 's'等位基因在健康对照组中的频率为3.3%,在原发性骨质疏松组为10％,而在2型糖尿病合并骨质疏松组为7.6%, 但组间分布差异无显著性（p>0.05）。SS型较Ss型在腰椎有较高的骨密度（p＝0.04）,而不同基因型间骨转换指标无明显差异（p>0.05）。结论 广州地区汉族人群中's'等位基因可能与低骨密度相关。     

Ⅰ型胶原—整合素α2β1系统对成骨细胞生物学特性的调控

为进一步探讨Ⅰ型胶原及其受体系统是否为成骨细胞功能活动所必需,使用Ⅰ型胶原和整合素α２β１的一抗阻断Ⅰ型胶原－整合素α２β１系统,以细胞计数法比较成骨细胞的增殖能力,流式细胞仪分析成骨细胞的凋亡情况,ＲＴ－ＰＣＲ技术研究Ⅰ型胶原、整合素α２β１及骨钙素的ｍＲＮＡ表达情况。结果发现阻断Ⅰ型胶原－整合素α２β１系统后,成骨细胞的增殖能力减弱,凋亡率增高,Ⅰ型胶原、整合素α２β１及骨钙素的ｍＲＮＡ表达减     

维拉帕米阻断TGF-β1诱导的α1(Ⅰ)胶原基因启动子的激活

目的：探讨维拉帕米对α1(Ⅰ）胶原基因启动子活性的影响。方法：将人α1(Ⅰ）胶原基因启动子重组体pCOLH1.5、pCOLH2.5转染至大鼠肾小球纱膜细胞，分别经不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1）和纺拉帕米处理后，ELISA法测定细胞CAT表达水平。结果：TGF－β1作用后，pCOLH1.5和pCOLH2.5的CAT活性明显增加，分别为对照组的1.498和1.551倍；维拉帕米对两上重组体的CAT表达均有抑制作用，与单纯TGF－β1组比较，维拉帕米加TGF－β1组pCOLH2.5的CAT活性明显降低（维拉帕米低浓度组P＜0.05，高浓度组P＜0.01）。结论：维拉帕米不仅直接抑制启动子的活性，而且还部分阻断TGF－β1诱导的α1(Ⅰ）胶原基因启动子激活。     

人α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性研究

目的：探索器官纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动片段。方法：从人α１（Ⅰ）胶原基因转录起始点上游－２．５ｋｂ￣＋４２ｂｐ的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因的质粒组成６个重组体,脂质体法转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞。ＣＡＴ－ＥＬＩＳＡ测定细胞ＣＡＴ表达水平以比较各重组体的启动子活性。结果：－２４８３￣＋４２ｂｐ,－２６８￣＋４２ｂｐ     

I型胶原α1链基因-1997G→T突变对成骨细胞生物学性能的影响

目的 研究I型胶原α1链(COL I Al)基因-1997G→T突变对成骨细胞生物学性能的影响,初步探讨COL I Al基因-1997G/T多态性影响骨矿物密度(BMD)的病理机制.方法 取行髋、膝关节置换患者的松质骨原代培养成骨细胞,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对成骨细胞进行基因型鉴定,筛选出GG、GT、TT三个基因型的细胞株,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测COL I Al mRNA表达量;ELISA法测其合成I型胶原的量;并测成骨细胞增殖率、骨碱性磷酸酶(BALP)的活性、细胞基质钙含量以及钙结节数量.结果 成功筛选出GG、GT、TT三个基因型的成骨细胞株.TT型成骨细胞的COL I Al mRNA表达量、I型胶原含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量均低于GG、GT型(P<0.01),GT型与GG型之间差异无统计学意义(P>0.05).而年龄、细胞增殖率、BALP活性三个基因型的成骨细胞之间差异无统计学意义(P>0.05).结论 COL I Al基因-1997G→T突变可减少成骨细胞COL I Al mRNA表达量、I型胶原的含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量.TT型成骨细胞I型胶原合成的减少导致细胞外基质减少,钙质沉着部位不足可能是-1997G/T患者BMD降低的原因.     

人工反义基因对HLF细胞α1(Ⅰ)胶原基因表达的抑制作用

目的 研究纤维增生性疾病与Ⅰ型胶原蛋白异常表达的关系。方法 通过构建人工反义α1（Ⅰ）胶原基因真核表达质粒,探索反义 RNA对人胚肺成纤维细胞（HLF 细胞）α1（Ⅰ）胶原基因表达的抑制作用。结果 含有第Ⅰ内含子与第Ⅲ外显子区域的反义α1（Ⅰ）胶原基因片段的真核表达质粒能够在转录和翻译两个水平抑制α（Ⅰ）胶原基因的表达。其中mRNA水平的抑制率为56.84%; 蛋白水平的抑制率为54.24%。结论 反义RNA能够在转录和翻译两个水平抑制HLF细胞α1（Ⅰ）胶原基因的表达。     

地塞米松对人α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响

目的：探讨地塞米松对人α１（Ⅰ）原胶原基因调控序列的作用。方法：用组织块法原代培养人皮肤成纤维细胞并进行传代培养作为本研究的模型细胞。（１）采用ＢｒｄＵ掺入的ＥＬＩＳＡ法，测定经不同浓度地塞米松处理２４ｈ后成纤维细胞的增殖情况。（２）构建含长短不一的人α１（Ⅰ）原胶原基因５’侧翼序列与氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因的３种重组质粒，以脂质体法转染人皮肤成纤维细胞，ＥＬＩＳＡ法测定不同浓度地塞米     

Ⅰ型胶原-整合素α2β1系统对成骨细胞生物学特性的调控

为进一步探讨I型胶原及其受体系统是否为成骨细胞功能活动所必需, 使用Ⅰ型胶原和整合素α2β1的一抗阻断Ⅰ型胶原整合素α2β1系统,以细胞计数法比较成骨细胞的增殖能力,流式细胞仪分析成骨细胞的凋亡情况,RTPCR技术研究I型胶原、整合素α2β1 及骨钙素的mRNA表达情况。结果发现阻断I型胶原整合素α2β1系统后,成骨细胞的增殖能力减弱,凋亡率增高,Ⅰ型胶原、整合素α2β1 及骨钙素的mRNA表达减少,其中I型胶原一抗的阻断作用大于整合素α2β1的一抗,这种阻断作用具有可复性,随抗体的去除可部分恢复,表明Ⅰ型胶原整合素α2β1系统为成骨细胞功能活动所必需,构建骨组织工程的支架材料时要考虑到骨组织的基质成份,应为成骨细胞提供相对正常的胞外基质环境。