EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶（GST）-Rta185和GST-Rta150,并制备特异性多克隆抗体。方法 质粒表达载体pGEX-R185I、pGEX-R150I和pGEX-5X-3分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白。将纯化后的GST-R185、GST-R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清。结果 在细菌裂解液中检测到高表达量的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-Rta融合蛋白。应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST-Rta蛋白免疫家兔得到了特异性的多克隆抗体。结论 通过上述方法制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件。     

犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法: 以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21 后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG) 诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价。采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性。结果: 成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1:400 000。Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性。 结论: 本研究利用原核表达的MVC GST-NP1 融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础。     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

Mrell多克隆抗体的制备及初步鉴定

目的原核表达人Mrell蛋白,并制备出Mrell蛋白的多克隆抗体,为研究Mrell蛋白功能奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a—Mrell,然后转化受体茵E-coliBL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫免以制备出Mrell多抗血清,最后采用western—blot及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性。结果在受体茵E-coliBI。21中成功诱导表达出了GST—Mrell融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mrell蛋白抗血清,IP、western—blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U20S细胞株中Mrell蛋白,并能够正确清楚检测293T和U20S细胞株中的Mrell表达情况,具有良好的特异性和高效性。结论成功制备出了兔抗人Mrell蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mrell蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础。     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

人I型谷丙氨酸氨基转移酶的原核表达及抗血清的制备

目的：构建人谷丙氨酸氨基转移酶（ALT1）的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫家兔,制备ALT1抗血清．方法：从HepG2细胞中提取总RNA,RT—PCR扩增alt1基因,并将其克隆人pMD19-T载体中测序,将测序正确的目的基因克隆至PET-32a（＋）表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、WesternBlot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA,WesternBlot进行检测．结果：测序证实克隆的基因序列与GenBank中的ALT1序列相符;SDS—PAGE,Westernblot结果证实获得Mr为75×10^3的ALT1融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni^2＋亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1：100000,WesternBlot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合．结论：获得了ALT1重组蛋白及特异性多克隆抗体．     

阴道毛滴虫长寿保障基因Tv-LAG1的克隆和表达

目的克隆原生动物阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)长寿保障基因[longevityassurancegene1(LAG1)]的同源基因Tv-LAG1。构建Tv-LAG1原核表达重组体及表达其融合蛋白。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中筛选LAG1的同源基因,用pET41表达载体与Tv-LAG1cDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物用SDS-PAGE法鉴定。用纯化的融合蛋白免疫家兔,获得抗血清,采用Western-blot法对抗体特异性进行分析鉴定。结果成功构建pET41/Tv-LAG1原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白。用融合蛋白免疫家兔获得的抗体能特异性识别Tv-Lag1p/GST融合蛋白。结论Tv-Lag1p/GST融合蛋白获得高效表达,并成功纯化,初步实验证明具有一定的免疫原性,为研究Tv-Lag1p在模式生物阴道毛滴虫的细胞定位以及其功能奠定了基础。     

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备

目的 构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗.方法 采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的 蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体.结果 成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28 ℃, 5 h, 0.5 mmol/L IPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体.结论 成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法,并制备了其抗体.     

人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及免疫学特性分析

目的应用生物工程方法研制人巨细胞病毒包膜蛋白pp65,并行相应抗体制备的探讨性研究。方法利用DNA重组技术,以HCMVAD169病毒株基因组为模板,通过PCR克隆HCMVpp65基因。以pET32a( )为表达载体,构建重组质粒,并在E.Coli(DE3plys)中诱导表达。然后经柱层析获得纯化蛋白,由蛋白质印迹法验证蛋白的特异性。最后,免疫小鼠获取抗血清,检测抗体产生的效价。结果重组质粒经测序与Genebank序列一致,转染的细菌能高效表达目的蛋白,纯化后的蛋白能与已知单克隆抗体结合,免疫后的小鼠抗血清能同时识别重组蛋白和病毒抗原。结论重组表达的HCMVpp65全蛋白经纯化获得较高纯度,且保留良好的免疫原特性。为HCMV感染诊断用单克隆抗体的研制奠定了基础,并为HCMV感染的免疫诊断和治疗提供了新的研究方向。     

肺炎链球菌丝氨酸-苏氨酸激酶基因的原核表达及免疫血清的制备

目的制备抗肺炎链球菌(S.pn)丝氨酸-苏氨酸激酶(STKP)基因的特定区域的免疫血清,为疫苗研究奠定基础。方法 PCR扩增S.pn STKP蛋白C末端314个氨基酸区域的基因,将其克隆入pMD19-T载体,将鉴定正确的STKP基因从pMD19-T载体亚克隆至PET-32a(+)原核表达载体进行诱导表达;获得的可溶性蛋白经Ni2+柱纯化及Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗STKP血清,间接ELISA鉴定抗体效价,Western blot鉴定免疫血清特异性。结果成功将STKP基因特定序列克隆入PET-32a(+)原核表达载体并诱导表达,形式以可溶性表达为主,经Ni2+柱层析法纯化STKP,纯度达92%,免疫家兔制备出STKP免疫血清,间接ELISA检测抗体效价为1∶100 000,Western blot证实免疫血清能与目的蛋白特异结合。结论获得STKP重组蛋白及免疫血清,重组表达产物具有免疫原性,为S.pn多价联合蛋白疫苗研制奠定了基础。     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

Purification and immunity analysis of recombinant 6His-HPT protein expressed in E. coli

Objective To obtain HPT protein (Hygromycin B Phosphotmnsferase), a kind of plant selective maker gene product expressed from E.coli and to prepare the polyclonal antibody (pAbs) against it. Methods HPT cDNA fragment was obtained by PCR and was inserted into the prokaryotic expressing vector pBV222. Then the constructed recombinant plasmid pBV222-HPT was transfered into E.coli DH5α for HPT expression. The recombinant expressing system was confirmed by restriction endonuclease digestion, DNA sequencing and protein expression. E.coli cells were lysed by sonication and detergent dissolution. After cell membrane was extracted, the inclusion bodies were denatured by 8 mol/L Urea and purified with metal chelate affinity chromatography on Ni-NTA agarose under denaturing condition. The purified 6His-HPT was characterized by SDS-PAGE, and used to immunize rabbit. The titer and specificity of antisera were detected by ELISA and Western blot respecitively. Results Analysis of DNA sequence and restricted enzymes showed that the sequence of PBV222-HPT plasmid was correct. The amount of recombinant HPT expressed in E.coli accounted for 30% of total cellular proteins. From 1 liter of fermentative bacteria about 22 milligrams of pure recombinant HPT was isolated with purity above 95%. The recombinant HPT protein could produce high titer antiserum in rabbits and show good immunity activity. Western blot showed specific binding reaction between the antiserum to the purified 6His-HPT protein and their expressed products (plants protein and bacterial protein). Conclusion HPT protein can be expressed and purified from E.coli by a relatively simple method, which has high immunity activity.     

Purification and Immunity Analysis of Recombinant 6His-HPT Protein Expressed in E.coli

INTRODUCTION Selective marker genes are important for the production of genetically modified organisms (GMOs), and they are essential for the selection of modified cells at relatively low frequencies[1]. Marker genes are used to 搕ag?genes of interest and comprise several classes. Antibiotic resistance gene is one of the most commonly used markers in the modification process. The enzyme Hygromycin B Phosphotransferas (HPT) is a widely used selective marker in various animal a…     

抗人载脂蛋白E多抗的制备与纯化

利用纯化的人载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）作为抗原，常规免疫纯系大耳白家兔，获得高效价、高特异性的抗血清，抗体滴度经ＥＬＩＳＡ法检测达１：１２８００倍稀释度，抗体特异性检验证明抗体只与ａｐｏＥ反应。抗血清经ＰｒｏｔｅｉｎＡ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ亲和层析纯化，分离为碱性洗脱峰Ⅰ和酸性洗脱峰Ⅱ，峰Ⅱ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在分子量为２７ｋｄ和５４ｋｄ处呈现两条带，分别相当于抗体的重链和轻链的分子量，证明峰Ⅱ为纯化的抗体，这就为建立测定人血清ａｐｏＥ浓度的免疫学方法奠定了基础。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的：表达GST－p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST－p11特异性抗体。方法：将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达，用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST－p11蛋白制备多克隆抗体。结果：得到高表达量的融合蛋白，经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST－p11和6xHis-p11蛋白。以GST－p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体，Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白，具有较高特异性。结论：利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性，为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的 :表达GST p11和 6xHis p11融合蛋白并制备GST p11特异性抗体。方法 :将人p11基因克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pQE30 ,分别在大肠杆菌BL2 1和M15中表达 ,用GlutathioneSepharose 4B和Ni NTAagar ose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST p11蛋白制备多克隆抗体。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST p11和 6xHis p11蛋白。以GST p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体 ,Westernblotting证实该抗体能够识别 6xHis p11蛋白 ,具有较高特异性。结论 :利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性 ,为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障