3例杜氏肌营养不良家系基因诊断策略探讨

目的：对3例既往多重PCR基因检测阴性的杜氏肌营养不良（DMD）家系进一步进行基因诊断及家系成员遗传指导。方法收集先证者及其家系成员的临床资料和基因组DNA ,多重连接依赖的探针扩增（MLPA）或第2代高通量测序对DNA样本进行DMD基因突变检测。结果家系1检测到3名男性Exon 7缺失,2名女性杂合子携带者。家系2先证者chrX‐32486626的Exon 23发现c ．3127C＞ T ,其母chrX‐32486626存在c ．3127C＞ T杂合突变,患儿母亲目前孕中胎儿系女孩。家系3先证者chrX‐32509581的Exon 20发现c ．2411G＞A ,其母chrX‐32509581存在c ．2411G＞ A的杂合突变。结论 MLPA或联合第2代高通量测序能够有效基因确诊DMD患者及其家系成员,为遗传咨询及产前诊断提供依据。     

血友病B家系的基因测序与高危胎儿的产前诊断

目的:对3个血友病B家系进行凝血因子Ⅸ(F9)基因突变分析,并对家系中的4个高危胎儿行产前诊断。方法:采用PCR反应和扩增后DNA直接测序技术对3个家系先证者及其家系成员F9基因的8个外显子进行序列分析,确定先证者及携带者的基因型后取羊水或绒毛进行产前诊断。结果:3个家系患者中均检出了F9基因突变,分别为G79R(c.10487G>A)、17788DelG、IVS2+4A>T(c.6493A>T)突变,其中,17788DelG为国内外首次报道的突变。女性携带者中检测出上述位点的杂合突变。家系1和家系2中行产前诊断的男性胎儿未携带F9基因突变,家系3中女性胎儿携带有IVS2+4A>T杂合突变,出生后随访均证实产前诊断的结果。结论:F9基因G79R、17788DelG、IVS2+4A>T是3个血友病B家系的致病性突变,应用基因测序技术可以对血友病B家系行有效的基因和产前诊断。     

肝豆状核变性的ATP7B基因变异分析及产前诊断

目的 对肝豆状核变性家系行遗传学分析,明确该家系的遗传病因.方法 对家系中肝豆状核变性先证者行全外显子测序分析,Sanger测序对先证者及父母筛出的可疑致病变异进行验证,该父母孕育的二胎胎儿行羊水穿刺,行产前基因诊断.结果 发现先证者存在ATP7B基因复合杂合变异,即NM_000053.3:c.2333G＞T(p.Arg778Leu)错义杂合变异和NM_000053.3:c.208delC(p.Gln70Serfs* 4)缺失移码变异;其中,c.2333G＞T错义杂合变异来源于父亲,为数据库已经报道的变异;c.208delC缺失移码变异来源于母亲,暂未见报道.先证者母亲孕20周,行胎儿产前基因诊断,发现胎儿仅携带来源于母亲的ATP7B基因c.208delC移码杂合变异,c.2333位点为野生型,胎儿和先证者基因型不同,预测胎儿不会出现和先证者一样的肝豆状核变性的临床表型.结论 该肝豆状核变性先证者临床表型异常是由ATP7B基因复合杂合变异所致,为生二胎先证者父母的遗传咨询和产前诊断提供了理论依据.     

酪氨酸羟化酶基因新突变导致多巴反应性肌张力障碍家系分析

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍（DRD）家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序（NGS）的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者（先证者和其大姐）的酪氨酸羟化酶（TH）基因外显子14、9存在c.1481C>T（p.Thr494Met）、c.943G>A（p.Gly315Ser）复合杂合突变,父母分别携带一个杂合突变,其表型正常的二姐和50名正常对照者均未检测到该突变。【结论】TH基因c.1481C>T（p.Thr494Met）、c.943G>A（p.Gly315Ser）突变导致了该DRD家系的基因异常,并且发现了新的TH基因突变,扩展了DRD基因型与临床表型的关系谱,对DRD的早期精准诊断和治疗是改善预后的关键。     

一个LIG4综合征家系基因突变分析和产前诊断

目的对一个LIG4综合征家系进行基因突变分析和产前诊断。方法选择该家系疑似LIG4综合征的女患儿（先证者,现已死亡）及其父母外周血,通过目标序列芯片捕获技术获得LIG4综合征发病相关基因的可疑突变,用高通量测序技术对突变基因测序。再对突变基因进行Sanger测序验证。在确定家系突变基因型后,于母亲再次妊娠20周时抽取羊水,通过Sanger法验证进行高危胎儿的产前诊断。结果先证者携带LIG4基因的复合杂合突变,突变位点为c.833G＞C（p.A278L）,1271-1275del（p.K424fs）,两者均为已知突变。先证者父母为杂合突变携带者。胎儿的羊水细胞基因型亦有与先证者相同的LIG4基因型突变,家属选择终止妊娠。结论LIG4基因复合杂合突变是先证者患SCID的致病突变。通过芯片捕获高通量测序技术可以完成对LIG4综合征家系的基因突变分析和产前诊断。     

肋骨分叉-基底细胞痣-颌骨囊肿综合征两家系基因序列变异分析

两家系肋骨分叉-基底细胞痣-颌骨囊肿综合征先证者均为男性，因X线摄片见颌骨多发低密度影就诊，临床及影像学检查见胸廓畸形、小脑幕及大脑镰钙化、眶距增宽等表现。两例先证者分别检出PTCH1基因位点的c.C2541C>A(p.Y847X)和c.C1501C>T(p.Q501X)杂合突变，对比先证者及其家系相关成员基因序列，结果两例先证者的母亲外周血中均检出PTCH1基因位点的杂合突变，明确该突变均来源于母亲。其中一例先证者临床表现为智力低下，还检出FANCD2基因位点的c.C2141T(p.P714L)和c.G3343A(p.V1115I)杂合突变；另一例先证者智力正常，未发现FANCD2基因突变。两例先证者均行颌骨囊肿开窗减压联合刮治术，随访原病灶处骨质生长状况良好，至今均未见复发。     

一例Ⅰ型成骨不全家系的基因定位及突变检测

目的 对国内1例成骨不全(OI)家系进行基因突变及突变效应分析,为研究中国人群的成骨不全基因突变特点提供线索.方法 对成骨不全Ⅰ型胶原基因COL1A1和COL1A2所在的17号染色体和7号染色体分别进行连锁分析,对致病基因做初步判断,然后用聚合酶链反应扩增致病基因外显子,并测序检出基因突变.结果 该家系为COL1A1基因突变,所有患者在该基因的第8个内含子剪切受体位点处为AG→GG(IVS8-2A＞G)突变.结论 对比COL1A1基因突变数据库,该突变为一新发现突变.     

两个雄激素不敏感综合征家系中 AR基因突变检测

目的：对两个疑似雄激素不敏感综合征（ AIS）家系进行基因诊断和其他临床相关检查,旨在发现其致病基因并进行遗传咨询。方法：对两个AIS家系的先证者及相关成员行体格检查、染色体核型分析、内分泌检测及超声检查后,提取外周血全基因组DNA,扩增位于X染色体上AR基因的8个外显子,扩增产物测序后与基因库中正常人的序列进行比对,查找是否存在致病突变。结果：两个AIS家系的先证者均检测到AR基因突变,分别为c．2042T＞C（p．681I＞T）和c．1822C＞T（p．608R＞X）,家系中女性携带者中检测出了上述位点的杂合突变。家系1先证者行腹腔镜性腺切除术后证实性腺为睾丸。结论：AR基因的p．681 I＞T和p．608 R＞X是两个AIS家系患者的致病性突变;对AR基因进行基因检测是46,XY性发育异常,特别是AIS有效的诊断方式。     

联合氧化磷酸化缺陷症1型一家系临床表型及GFM1基因突变分析

目的: 分析一个联合氧化磷酸化缺陷症1型家系的临床表型及遗传学特点,明确其遗传学病因。方法: 对先证者父母外周血DNA行全外显子组测序,对先证者（已故）干血斑标本、胎儿（先证者弟弟）羊水和先证者父母亲外周血行Sanger验证。结果: 全外显子组测序和Sanger测序显示,先证者及其弟弟均为GFM1基因c.688G>A（p.G230S）与c.1576C>T（p.R526X）复合杂合突变,其中c.1576C>T系首次报道。先证者及其弟弟出生后均出现代谢性酸中毒、高乳酸血症、肝功能异常、喂养困难、小头畸形、生长发育落后、癫痫等临床表现,均在婴儿早期死亡。结论: GFM1基因c.688G>A与c.1576C>T复合杂合突变是导致该家系联合氧化磷酸化缺陷症1型的遗传学原因。     

甲状腺激素受体β基因突变致甲状腺激素抵抗综合征家系分析

目的：对1例甲状腺激素抵抗综合征（RTH）先证者及其家系成员进行甲状腺激素受体β（TRβ）基因突变检测,并分析误诊情况。方法：取得先证者及家系成员知情同意后,收集RTH先证者及家系成员的临床资料,抽取先证者及其余10名家系成员的外周血抽提基因组DNA,应用PCR扩增TRβ基因的3-10号外显子编码区并直接测序,分析家系成员误诊情况。结果：11名家族成员中共发现3名患者,DNA测序结果显示先证者及其儿子、母亲TRβ第9外显子存在c.1234 A＞G（p.A317T）错义突变,为杂合突变。先证者表现为心悸消瘦,先证者儿子表现为多动,先证者母亲症状不明显。先证者和其儿子因在外院被误诊甲状腺功能亢进症已行放射性碘治疗,需终身甲状腺激素替代,先证者母亲因症状隐匿未被误诊误治。结论：TRβ基因第9外显子c.1234 A＞G突变是引起本家系RTH的原因,提高对该病的认识有助于避免不适当的治疗。     

脑脊液二代测序对病毒性脑炎的诊断价值：附三例报告

病毒性脑炎是一种累及脑膜和脑实质的中枢神经系统感染性疾病，其临床表现为发热、抽搐、头痛等。因病毒性脑炎早期缺乏特异性临床症状，且病死率和致残率均较高，所以早期诊断尤为重要。本文介绍了3例采用宏基因组测序（mNGS）技术早期诊断出儿童疱疹病毒性脑炎的病例资料，相较于病毒性脑炎的传统检测方法，脑脊液二代测序能及早地做出病原学诊断，在早期诊断和指导临床治疗方面有重要的参考价值。     

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

目的:了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性(SNP)检测上的差别.方法:对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应(PCR)扩增,分别对其产物进行直接测序和克隆测序.结果:在样本的检测中, PCR产物直接测序法所测序列与43～60 bp以后克隆测序相同;检出一个突变位点并与GenBank( DQ012938)发表序列一致.结论:PCR 产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法,但前者不仅特异性强,敏感度高,而且比克隆测序方法更为快速简便,节省材料.     

原发性干燥综合征患者肠道菌群特点分析

目的 探索原发性干燥综合征（pSS）与健康人之间肠道菌群是否存在差异。方法 收取18例符合纳入标准的女性pSS患者的粪便样本,其中9例为病情活动组（A组）、9例为病情不活动或低活动组（B组）,另外收取10例健康人的粪便（C组）。收集每份粪便样品的细菌总DNA,PCR扩增,针对16SrDNA基因的V3~V4区进行illumina hiseq 2500高通量测序,得到3组的肠道菌群生物信息数据,随后结合文献智库信息挖掘进行组间OTU分析、样品多样性分析、样品组间显著性差异分析及LEfSe分析。结果 肠道菌群多样性比较：α多样性（Alpha diversity）指数分析,Shannon指数在A组和B组间、Simpson指数在A组和B组间及A组和 C组间差异存在统计学意义（P<0.05）;菌群结构比较：将3组分别进行序列分析,在门水平上3组均主要有 4 个菌门组成,分别是：厚壁菌门（Firmicutes）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,放线菌门（Actinobacteria）,变形菌门（Proteobacteria）,在属水平上3组均主要有4个菌属组成,分别是：大芬戈尔德菌属（Finegoldia）,普雷沃菌属（Prevotella）,链球菌属（Streptococcus）,棒状杆菌属（Corynebacterium_1）,在门水平和属水平上分析显示3组肠道菌群主要菌门和主要菌属两两比较差异无统计学意义（P>0.05）,但Streptococcus属在3组之间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;肠道菌群结构的差异分析：肠道菌群 16S V3~V4 区组间显著性差异分析,在属水平上,3 组间相比,在 Alloscardovia 属、Bacteroides 属、Barnesiella 属 、Butyricicoccus 属 、Facklamia 属 、Faecalibacterium 属 、Lachnospiraceae_FCS020_group 属 、 Lachnospiraceae_ND3007_group属、Lachnospiraceae_UCG-001属、Lachnospiraceae_UCG-004属、Lachnospiraceae_UCG-008属、Ruminococcaceae_UCG-002属、Streptococcus属之间存在统计学差异（P<0.05）;在Coprococcus_1属存在显著性差异（P=0.005,P<0.01）。3组间肠道微生物进行高维生物标识和揭示基因组特征的分析,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论 pSS患者与健康人之间的肠道菌群多样性存在一定差异,在主要菌门水平和菌属水平上虽无显著性差异,但在Streptococcus属等一些特定细菌比例有显著差异;3组肠道菌群在16S V3~V4区组间差异具有统计学意义,提示菌群结构的差异在pSS的发病中起一定作用。     

BCG感染牛肺泡巨噬细胞的转录组测序和分析

目的：通过卡介苗（BCG）感染牛肺泡巨噬细胞（BAM）的转录组测序及生物信息学分析,揭示差异表达的基因和长链非编码RNA （lncRNA）,为巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫调控机制研究提供理论依据。方法：采用肺脏灌洗离心法收集并培养BAM,分为感染组和未感染组,感染组经BCG感染后12h,利用转录组测序技术（RNA-Seq）检测感染组和未感染组BAM mRNA表达谱及lncRNA表达谱,并进行生物信息学相关分析。结果：与未感染组比较,感染组BAM差异表达的lncRNAs共有119个（P<0.05）,差异表达的mRNA共有1 111个（P<0.05）。在差异表达基因的功能富集分析中,最显著富集项与免疫功能相关（GO：0006955,P<0.05）,共有125个基因,其中有63个基因表达上调,62个基因表达下调,且白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素17（IL-17）和白细胞介素23A （IL-23A）等促炎因子表达上调。lncRNA靶基因预测,差异表达的lncRNA参与转化生长因子β（TGF-β）信号通路及ABC转运体信号通路的调控（P<0.05）。结论：BCG感染BAM后,激发宿主细胞产生强烈的免疫反应,引起lncRNA和mRNA表达谱的改变。     

唐氏综合征胎盘差异miRNA表达谱分析： 基于全转录组测序分析技术

目的 通过筛选唐氏综合征胎盘中表达变化的miRNAs并分析具体生物学途径来探讨唐氏综合征新的标记物及其分子发病机制。方法 运用全转录组测序分析技术分析唐氏综合征确诊胎盘（DS,n=3）和产前诊断确诊正常胎盘（n=3）样本,筛选出显著差异表达的miRNA,通过miRWalk、Targetscan、miRDB软件预测其靶基因并进行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。结果 测序分析共检出82个差异表达的miRNA。DS胎盘组织中有29个miRNA表达上调（变化倍数≥2,P<0.05）,15个miRNA表达下调（变化倍数≥2,P<0.05）;根据表达丰度共筛选出 4 个表达上调的 miRNA,6 个表达下调的 miRNA。其共同靶基因BTBD3、AUTS2均与神经发育相关。GO富集分析结果显示差异表达miRNA的靶基因主要富集到蛋白结合、水解酶活性、金属离子结合、转移酶活性、核苷酸结合、胞质组分、细胞核组分、转录调控、RNA代谢过程调控、DNA依赖性RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、眼睛发育、感觉器官发育等。KEGG富集分析结果显示差异表达miRNA靶基因主要参与的信号通路包括肿瘤相关信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、细胞骨架调控信号通路、嘌呤代谢相关信号通路、P53相关信号通路。结论 miRNAs可能参与了唐氏综合征胎盘损伤和相关的妊娠病理,并可能对其他智力障碍相关疾病提供一定临床思路及对未来的预防治疗发挥重要作用。     

长读长测序技术在肿瘤领域中的应用:进展与挑战

相较于目前普遍应用的二代测序（NGS）技术，长读长测序（LRS）技术是一种能够连续读取数百万个碱基对的测序技术。本文回顾了单分子实时测序技术、牛津纳米孔测序技术和新型单分子LRS技术在肿瘤领域的研究应用。LRS技术能够更精确地检测肿瘤基因组变异，包括结构变异、拷贝数变化、基因融合等。除基因组变异检测外，LRS技术还为描绘转录组图谱、表观遗传修饰图谱提供了有效手段。LRS技术可以有效弥补NGS技术的部分技术瓶颈，深入揭示生物大分子在健康和疾病状态下的复杂性状，为更好地理解肿瘤的发生与发展机制、制定治疗策略和开发药物提供新的理论基础。此外，本文还展望了LRS技术在肿瘤领域临床应用 中的潜在价值。     

基于二代测序技术ghrelin作用后人卵巢癌细胞差异表达lncRNA的生物信息学分析

目的 分析二代测序技术ghrelin作用后的人卵巢癌细胞株SK-OV-3中长链非编码RNA（lncRNA）的差异表达。方法 从对照组（不添加ghrelin）和实验组（添加600 ng/mL ghrelin 24 h）的人卵巢癌细胞株SK-OV-3中分别提取RNA进行测序，筛选出实验组发生差异表达的lncRNA，对其进行靶基因预测并将预测结果与差异mRNA取交集，对取交集后的基因进行GO分析和KEGG通路分析。结果 筛选获得差异表达的lncRNA有236个（上调130个，下调106个）；差异表达mRNA有71个（上调66个，下调5个）。差异表达lncRNA靶基因与差异表达mRNA取交集筛选获得57个基因。GO和KEGG通路富集分析结果显示：这些差异表达lncRNA主要与精、赖氨酸跨膜转运，氧化应激反应及发育过程相关，并且主要富集在细胞因子受体信号通路、胰高血糖素和胰岛素信号通路及癌症相关信号通路上。结论 ghrelin作用后的人卵巢癌细胞中lncRNA的表达有差异，其可能参与卵巢癌的发生、发展，提示ghrelin可能在卵巢癌治疗中具有重要作用。     

Characterization of cytotoxic compound from marine sediment derived actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4

Objective

To investigate the cytotoxic activity of actinomycete isolated from marine sediment.

Methods

In the present study the DNA was isolated and the ITS region of 16s rRNA was amplified by polymerase chain reaction, using two universal bacterial primers, 1492R (5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′) and Eubac27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′). The amplified products were purified using TIANgel mini purification kit, ligated to MD18-T simple vector (TaKaRa), and transformed into competent cells of Escherichia coli DH5α. 16S rRNA gene fragment was sequenced using forward primer M13F (-47) and reverse primer M13R (-48). Blast search sequence similarity was found against the existing non-redundant nucleotide sequence database thus, identified as Streptomyces sp SU, Streptomyces rubralavandulae strain SU1, Streptomyces cacaoi strain SU2, Streptomyces cavourensis strain SU3, Streptomyces avidinii strain SU4, Streptomyces globisporus strain SU5, Streptomyces variabilis strain SU6, Streptomyces coelicolor strain SU 7. Among the eight identified isolates, one actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4 was selected for further study.

Results

Crude extract of the actinomycete isolate exhibited IC₅₀ in 64.5 µg against Hep-2 cell line, 250 µg in VERO cell line. This value is very close to the criteria of cytotoxicity activity for the crude extracts, as established by the American National Cancer Institute (NCI) is in IC₅₀ < 30 µg/mL. The GC MS analysis showed that the active principle might be 1,2-benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) ester (12.17%), isooctyl phthalate (15.29%) with the retention time 15.642 and 21.612, respectively.

Conclusions

This study clearly proves that the marine sediment derived actinomycetes with bioactive metabolites can be expected to provide high quality biological material for high throughout biochemical and anticancer screening programs. These results help us to conclude that the potential of using metabolic engineering and post genomic approaches to isolate more bioactive compounds and make their possible commercial application is not far off.     

适用于单细胞RNA测序的半月板细胞提取方法的优化

目的 优化半月板细胞提取的方法,缩短细胞提取时间,稳定地获取细胞数量多和细胞活率高的细胞悬液,使获得的细胞悬液悬液适用于单细胞RNA测序。方法 比较细胞悬液的细胞数量及细胞活率评价不同细胞提取方法的有效性,细胞提取方法包括传统半月板细胞提取法（短时间消化和长时间消化）和优化提取法;通过分析单细胞RNA测序数据集评价优化提取法获取的细胞悬液的稳定性;通过比较优化提取法获得的单细胞RNA测序数据集与公开的半月板单细胞RNA测序数据集,分析优化提取法的可靠性。结果 在3次重复实验中,优化提取法获得细胞数量最多的细胞悬液,细胞数量超过105,且细胞活率最高,平均达80%。通过分析单细胞RNA测序数据发现每个样本中80%以上细胞的线粒体基因含量少于20%。CD34+,MCAM+细胞以及COL1A1+胞均存在每个单细胞RNA测序数据集中。在比较基于优化提取法单细胞RNA测序数据集与公开的半月板单细胞RNA测序数据集时发现,优化提取法也能捕获COL3A1+细胞,COL1A1+细胞,MYLK+细胞,BMP2+细胞,CD93+细胞和CDK1+细胞。结论 优化细胞提取方法能稳定地获得适用于10×Genomics平台的单细胞RNA测序技术的单细胞悬液。     

学龄期儿童肉类食品摄入模式对其肠道菌群结构的影响

目的 研究不同肉食偏好模式下学龄期儿童的肠道菌群差异。方法 选取深圳地区学龄期健康儿童共44例,年龄范围8~10岁。根据每个儿童白肉和红肉的月均摄入频率的比值将所有儿童分为3组：红肉模式组（15例）、均衡组（16例）、白肉模式组（13例）。采用膳食频率调查问卷进行面访调查及采集晨便,提取粪便DNA后进行扩增并使用 Illumina Miseq 高通量测序技术对儿童肠道菌群测序分析。结果 红肉偏好模式和白肉偏好模式的儿童肠道菌群的丰度和多样性均显著低于均衡饮食模式（P<0.05）。LEfSe分析发现与均衡组相比,红肉组的样本中主要富集埃希-志贺菌属、粪芽孢菌属和嗜冻菌属,白肉组主要富集霍尔德曼氏菌属,而与红肉组和白肉组相比均衡组分别显著富集了31和25个菌属,包括毛螺菌属、瘤胃球菌属等。采用PICRUSt2对细菌功能信号通路预测发现,与均衡组相比红肉组显著激活菌群脂多糖生物合成（P<0.01）、花生四烯酸代谢（P< 0.01）、甲状腺激素合成（P<0.001）和碳水化合物消化吸收功能（P<0.05）;但相比白肉组,红肉组仅显著激活菌群花生四烯酸代谢（P<0.05）和甲状腺激素合成通路（P<0.05）。结论 本研究发现相比均衡模式,红肉和白肉偏好模式均会显著下调肠道菌群丰度及改变菌群结构,并且红肉模式饮食可能会更多富集埃希-志贺菌属,并可能显著上调脂多糖生物合成通路。