利用groupⅡ intron构建产气荚膜梭菌突变体

目的通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)突变体。方法利用MobilegroupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活。通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上的形态变化,进行阳性筛选。蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性。结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上无白晕。蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白。结论成功构建C.perfringensα毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础。     

宁夏汉族人126名甘露糖结合凝集素基因多态性分析

目的检测宁夏汉族人群中甘露糖结合凝集素(MBL)基因多态性,获得数据为进一步研究MBL基因突变与疾病间的关联性提供依据。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测126名宁夏汉族健康个体的MBL基因3个多态性位点,并与广东汉族人群MBL基因多态性的分布进行比较。结果在宁夏汉族人群中,只检测出两种等位基因:野生型A和变异型B,未检出变异型C、D等位基因,同时发现MBL基因的基因频率A为0.853 2,B为0.146 8,基因型频率分别是AA为0.714 3,AB为0.277 8,BB为0.007 9。结论宁夏汉族MBL基因多态性符合Hardy-Weinberg平衡定律,具有群体代表性,与文献中的广东汉族人群相比较有一定的差异。     

左旋苦豆子总碱可增加扩展β-内酰胺酶产生的大肠杆菌分离株对头孢噻肟、头孢他啶的敏感性

Objective： To evaluate the antimicrobial activity of total alkaloids extracted from Sophorea alopecuroides L. （TASA） against clinical isolated extended-spectrum beta-lactamases （ESBLs） producing Escherichia coil （E.. coil） strains. Methods： The antibacterial activity of TASA either itself or in combination with cefotaxime （CTX） or ceftazidime （CAZ） was investigated by using the microbroth dilution method and phenotypic confirmatory disk diffusion test against three clinical isolated ESBLs-producing E. coil strains; the interactions of TASA and C＇I＇X or CAZ were ascertained by evaluating the fractional inhibitory concentration index （FICI）. Results： The antibacterial activity of either TASA itself or in combination with C＇IX or CAZ was found. The minimum inhibitory concentration （MICs） of TASA against the ESBLs producing isolates was 12.5 mg/mL. In the combinations with a sub-inhibitory concentration of TASA, a synergistic effect on CTX and CAZ against the ESBLs producing isolates was observed. Similarly, the isolates exposed to lower dose of TASA yielded an increased susceptibility to CTX and CAZ by 8-16 folds determined by microdilution assay. Moreover, enzymatic detection of ESBLs demonstrated that TASA induced reversal resistance to CTX and CAZ partially by a mechanism of inhibition of ESBLs activity in these isolates. Additionally, in the tested isolates following the exposure of TASA, molecular analysis verified the SHV-type beta-lactamase encoding ESBL gene in these isolates, and no mutation was introduced into the ESBL gene. Conclusions： These results suggest that TASA could be used as a source of natural compound with pharmacological activity of reversal resistance to antimicrobial agent. These findings also indicated that the application of the TASA in combination with antibiotics might prove useful in the control and treatment of infectious diseases caused by the ESBLs producing enterobacteriaceae.     

抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST1 McAb杂交瘤细胞系的建立及应用

目的 耐热性肠毒素ST1单克隆抗体制备及在感染性腹泻诊断中的应用。方法 应用基因工程菌株分泌的肠毒素制备ST1包涵体，免疫Balb／c小鼠，成功制备了3株特异性抗ST1的单克隆抗体细胞株，用其中1株McAb建立了检测ST1的双单克隆抗体夹心ELISA法。结果 检测52株从临床腹泻病人粪便中分离的大肠杆菌，检出ST1阳性率为26．92％，与ST1检测的经典方法乳鼠灌胃法符合率为96．15％。结论 该方法是一种简捷、灵敏和特异的检测方法，具有实际应用价值。     

CPB-ST融合基因的构建及表达研究

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ双酶切含有大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１前体蛋白基因的质粒ｐＸＳＴ１，回收３２５ｂｐ的ＳＴ基因片段，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的带有产气荚膜梭菌β－毒素基因（ＣＰＢ）的重组质粒ｐＥＣＢ２中ＣＰＢ基因的下降，转化受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切反应鉴定重组质粒，得到了理想重组质粒ｐＥＣＢ－ＳＴ１。重组菌株Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＣＢ－ＳＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ及ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以表达ＣＰＢ－ＳＴ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然β－毒素和ＳＴ１的生物毒性。     

宁夏汉族人群MBL基因54位点多态性研究

目的:探讨宁夏汉族人群中甘露糖结合凝集素(MBL)基因54位点多态性,为进一步研究MBL基因突变与乙型肝炎间的关联性提供依据。方法:采用PCR-RFLP方法,对111例来自于宁夏地区的汉族健康个体检测静脉血。结果:MBL54位点的基因频率分别为A为0.8468,B为0.1532,基因型频率:A/A为0.7027,A/B为0.2883,B/B为0.0090。结论:宁夏汉族MBL54基因多态性符合Hardy-Weinberg平衡定律,具有群体代表性,并且与广东汉族相比有极显著性差异。     

枸杞子中2Oβ-D葡萄糖基-L-抗抗坏血酸抑制黑素合成的研究*

目的:研究枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)对体外培养的B16黑素瘤细胞黑素合成的影响及作用机制。方法:不同浓度的AA-2βG作用于B16黑素瘤细胞,测定细胞的增殖率、酪氨酸酶活性和黑素含量,并以维生素C(Vc)作对照。结果:AA-2BG在浓度为2．96和4．44mmol·L~(-1)时,对B16细胞增殖抑制率可达75．99％和85．97％,对黑素合成的抑制率为32．29％和58．75％;AA-2βG对细胞生长中酪氨酸酶活性的半抑制率浓度(IC_(50))为1．84mmol·L~(-1),而Vc则为3．85mmol·L~(-1),表明AA-2βG对酪氨酸酶抑制效果优于Vc。结论:AA- 2βG具有明显的抑制细胞黑素合成作用。     

利用groupⅡ intron构建产气荚膜梭菌突变体

目的通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）突变体。方法利用MobilegroupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活。通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基（4%卵黄）平板上的形态变化,进行阳性筛选。蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性。结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基（4%卵黄）平板上无白晕。蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白。结论成功构建C.perfringensα毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础。     

筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究

目的 建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10 的高亲和性适体.方法 体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX 技术筛选获得CFP-10的适体库.将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力.结果 构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体.     

宁夏地区回、汉族人群HLA-DQA_1基因多态性分析

目的:了解宁夏地区回、汉族人群HLA-DQA1基因多态性的分布情况。方法:采用PCR-RFLP方法对宁夏地区81例回族、80例汉族个体HLA-DQA1等位基因进行分型。结果:宁夏地区回、汉族人群均检出8个DQA1等位基因。其中在宁夏回族人群中,HLA-DQA1*0401的频率最高(30.25%),DQA1*0201的频率最低(1.23%);而在汉族人群中HLA-DQA1*0601的频率最高(20%),DQA1*0301的频率最低(5.63%)。结论:宁夏回、汉族人群HLA-DQA1等位基因的构成具有显著性差异(P<0.01)。