SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能.方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达.Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型.     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87凋亡的影响

目的：研究外源性抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87凋亡的影响,探索膀胱癌基因治疗的新途径.方法：将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染BIU-87细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测PTEN的表达情况,应用细胞原位凋亡检测试剂盒和流式细胞仪分别研究PTEN基因转染前、后膀胱癌细胞凋亡的变化.结果：转染PTEN基因的膀胱癌细胞系BIU-87中PTEN mRNA能稳定表达,肿瘤细胞凋亡明显增多,与对照组比较有显著性差异.结论：转染外源性PTEN基因能显著诱导膀胱癌细胞凋亡,从而达到抑制肿瘤发生、发展的目的.     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定

目的：构建人淋巴细胞趋化因子(HLptn)真核表达质粒，在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达重组质粒，并检测趋化活性。方法：用RT-PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增HLptn含编码区序列的cDNA，克隆至pGM-T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcDNA3．1( )．HLptn；用脂质体介导其转染BIU-87细胞，用Western-blot检测转染后细胞中HLptn的表达；取转染后的上清液，采用Boyden小室法检测表达的HLptn趋化CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞的生物学活性。结果：克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同，系同义突变，构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-HLptn；转染的BIU-87细胞表达HLptn，其培养上清对CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞具有趋化活性。结论：成功构建的HLptn真核表达系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的构建人淋巴细胞趋化因子(human lymphotactin，hLpm)真核表达质粒，并在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中的表达重组质粒。方法用RT—PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hLpm的含编码区序列的cDNA，克隆至pGM—T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcD—NA3．1( )-hLpm，用脂质体将其转染BIU-87细胞，经G418筛选稳定表达克隆，用免疫荧光染色技术鉴定经筛选的克隆。结果克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同．系同义突变；构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-hLptn；筛选获得了稳定表达转染hLpm的BIU-87细胞株。结论成功构建的hLpm真核表述系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中稳定表达，为研究hLpm基因介导的人膀胱肿瘤特异性主动免疫治疗奠定了基础。     

CH50多肽在膀胱癌细胞系BIU-87中的表达和鉴定

目的：研究CHS0多肽真核表达载体pCH510体外转染膀胱癌细胞系BIU-87以及CHSO多肽的表达和鉴定。方法：以脂质体Lipofectimine^TM2000为介导，将pCH510质粒体外转染给BIU-87细胞，用免疫组化S-P法、Western Blot法鉴定CH50多肽的表达，RT—PCR法鉴定导入基因的表达。结果：转染pCH510质粒的BIU-87细胞明显阳性表达CH50多肽，对照组则不表达。结论：BIU-87细胞体外转染pCH510质粒后能表达CH50多肽，改变了癌细胞的黏附属性，为临床治疗膀胱癌提供了新的途径。     

Apoptosis inducing effects of arsenic trioxide on human bladder cancer cell line BIU-87

Objective　To explore the apoptosis inducing effects of arsenic trioxide (As2O3) on human bladder cancer cells and elucidate possible mechanisms. Methods　After treatment with As2O3, the growth inhibition rates of human bladder cancer cell line BIU-87 were studied by MTT and cell counts methods. DNA synthesis rates were detected by 3　H-TdR assay. The morphological changes of cancer cells were observed by light and electronic microscopy and cell apoptosis rates were detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). bcl-2 gene expression of BIU-87 cells was observed by strept avidin-biotin complex (SABC) immunohistochemical method. Results　As2O3 could effectively inhibit the growth of BIU-87 (P<0.05), which were time and concentration dependent. The inhibition rate of 4.0?μmol/L As2O3 for DNA synthesis of cancer cells was 55.64% (P<0.01). Partial cancer cells presented the characteristic morphological changes of apoptosis which depended on the time of exposure to drug (P<0.05). bcl-2 expression of BIU-87 cells was decreased significantly (P<0.05). Conclusion　As2O3 can significantly induce apoptosis in bladder cancer cells by down-regulating the expression of the bcl-2 gene and inhibiting DNA synthesis. This provides a potentially effective method for prevention and cure of human bladder cancer.     

bcl-2基因过表达致急性髓系白血病对柔红霉素耐药机制的初步探讨

目的 探讨bcl-2基因过表达导致人急性髓系白血病对柔红霉素耐药的机制.方法 通过分子克隆技术构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,将其转染人急性髓系白血病U937细胞,分正常对照组、空载体对照组、转染组,与柔红霉素培养24 h,采用CCK-8法检测细胞增殖率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化,从而比较转染bcl-2基因前后,U937细胞对柔红霉素敏感性的变化.结果 成功构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,转染入U937细胞,PCR证实其转染效果;CCK-8法检测结果显示U937/ bcl-2组细胞存活率显著高于对照组和空载体对照组;bcl-2基因过表达降低caspase-3片段的裂解活化,降低U937细胞对柔红霉素的敏感性.结论 bcl-2过表达抑制caspase-3激活、抑制柔红霉素杀伤U937细胞,导致细胞对柔红霉素耐药.bcl-2可作为临床治疗急性髓系白血病的靶点.     

RNA干扰沉默MTA1基因对膀胱癌细胞失巢凋亡的影响

目的： 观察RNA干扰沉默MTA1基因对膀胱癌细胞株BIU-87增殖和失巢凋亡的影响。方法： 构建针对MTA1基因的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）,应用MTA1 siRNA转染处理人膀胱癌细胞株BIU-87后,分别采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测MTA1基因mRNA和蛋白的表达,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测BIU-87细胞失巢凋亡。结果： 与对照组比较,MTA1 siRNA转染组MTA1 mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性（P<0.01）。MTA1 siRNA转染组软琼脂集落形成数明显减少,且与浓度相关（P<0.01）。琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术结果显示,MTA1 siRNA转染可诱导BIU-87细胞失巢凋亡,且与浓度相关（P<0.01）。结论： MTA1 siRNA可抑制膀胱癌细胞株BIU-87增殖,诱导失巢凋亡可能是其机制之一。     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

沉默核糖核酸酶抑制因子促进膀胱癌BIU-87细胞生长和转移潜能

目的研究沉默核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达,对人膀胱癌BIU-87细胞增殖和侵袭能力及肿瘤生长的影响。方法通过用RI mRNA的特异性siRNA表达载体和无同源性的对照载体,在脂质体介导下稳定转染膀胱癌BIU-87细胞,通过筛选、鉴定后,用Am-blue法检测细胞增殖能力及用Western blot分析细胞中MMP-2和MMP-9的表达。将siRNA RI BIU-87(实验组)及对照组细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中,观察肿瘤的生长和肿瘤微血管密度的变化,以及nm23-H1和E-cadherin在肿瘤中的表达。结果 RI基因表达下调显著增加了细胞的增殖,而且显著增强了MMP-2和MMP-9的表达。动物实验结果显示,实验组显著促进了肿瘤的生长(促瘤增长率31.85%),具有更大的瘤质量和更高的肿瘤微血管密度以及更低的nm23-H1和E-cadherin的表达。结论抑制RI基因的表达能显著提高膀胱癌细胞的生长和侵袭潜能,RI可能作为治疗膀胱癌的靶蛋白。