硫酸镁对脂多糖诱导巨噬细胞表达和释放高迁移率族蛋白1的影响

目的 探讨硫酸镁对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7表达和释放高迁移率族蛋白1( HMGB1)的抑制作用.方法 传代培养的小鼠RAW264.7细胞分5组接种于6孔板,每组为3孔.C组为仅加RPMI 1640培养液的对照组,LPS组为在RPMI 1640培养液的基础上加500 ng/mL LPS的诱导组,M1组为在LPS组基础上加1 mmol/L硫酸镁的干预组,M5组为在LPS组的基础上加5 mmol/L硫酸镁的干预组,M10组为在LPS组基础上加10 mmol/L硫酸镁的干预组.孵育24 h后,收集细胞及细胞培养上清液,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测各组细胞内HMGB1 mRNA表达水平和细胞培养上清液中HMGB1蛋白含量的变化.结果 M1、M5、M10组的RAW264.7细胞活性分别为1.35±0.10、1.34±0.11、1.31±0.08,差异均无统计学意义(P值均＞0.05).LPS、M1、M5、M10组细胞上清液中HMGB1蛋白的含量分别为(82.80±9.15)、(81.26±8.47)、(56.69±6.21)、(50.71±6.62)ng/mL,均显著高于C组(C组为0,P值均＜0.05);M5、M10组细胞上清液中HMGB1蛋白的含量均显著低于LPS及M1组(P值分别＜0.05或0.01).LPS、M1、M5、M10组细胞中HMGB1 mRNA的相对表达量分别为1.435±0.161、1.416±0.124、0.873±0.093、0.774±0.067,均显著高于C组的0.195±0.020(P值均＜0.05);M5、M10组细胞中HMGB1 mRNA的相对表达量均显著低于LPS及M1组(P值分别＜0.05或0.01).结论 硫酸镁抑制LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGB1,通过抑制与脓毒症致死性密切相关的关键炎性因子,可能对脓毒症患者具有一定保护作用.     

LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究

目的:观察LPS诱导RAW264.7细胞内HMGBl转位及其释放.方法:用不同浓度的LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h,用荧光显微镜观察LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1的分布情况.用West-ern blot方法检测HMGB1在胞核及培养上清中的水平.结果:LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h后,培养上清中的HMGB1水平明显增加,胞核HMGBl含量减少,并存在剂量依赖关系.结论:LPS能诱导RAW264.7细胞释放HMGB1,存在剂量依赖关系.     

低镁对脂多糖诱导巨噬细胞表达和释放高迁移率族蛋白1的影响

目的探讨低镁对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7表达和释放高迁移率族蛋白1(HMGB1)的促进作用。方法传代培养的小鼠RAW264.7细胞分为4组,接种于6孔板,每组为3孔,4组分别为含1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基组(C1组)、含0.1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基组(C0.1组)、含1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基加500ng/mLLPS的刺激组(L1组)和含0.1mmol/L硫酸镁的RPMI1640培养基加500ng/mLLPS的刺激组(L0.1组)。孵育24h后,收集细胞及细胞培养上清液,用反转录-聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验分别检测各组细胞内HMGB1mRNA表达水平和细胞培养上清液中HMGB1蛋白含量的变化。结果 C0.1组与C1组间HMGB1mRNA及蛋白表达的差异均无统计学意义(P值均>0.05),L1组和L0.1组HMGB1mRNA及蛋白的表达均显著高于C0.1组和C1组(P值均<0.05),L0.1组又显著高于L1组(P值均<0.05)。结论低镁促进LPS诱导的RAW264.7细胞表达和释放HMGB1,可能对脓毒症患者的预后有一定损害作用。     

瑞香素对HMGB1释放及HMGB1诱发的炎症反应的双重抑制作用

目的探讨瑞香素对高迁移率族蛋白1（HMGB1）释放及其诱发炎症反应的双重抑制作用。方法RAW264.7细胞常规培
养,不同浓度的瑞香素单独或联合脂多糖（LPS）作用细胞不同的时间,ELISA检测晚期炎症因子HMGB1的释放;Western blot
检测JAK1/2、STAT1的磷酸化。THP-1细胞常规培养,不同浓度的瑞香素单独或联合rhHMGB1刺激细胞不同的时间,ELISA
检测炎症因子TNF-α,IL-6,PGE2 的释放;NO检测试剂盒检测NO水平;Western blot 检测iNOS、COX-2 的表达及p38、ERK、
JNK的磷酸化水平。结果瑞香素浓度依赖性的下调HMGB1 的释放,抑制rhHMGB1 诱导的iNOS、COX-2 的表达及TNF-α,
IL-6,PGE2、NO的释放。WB结果显示,瑞香素显著下调脂多糖诱导的JAK-STAT1信号磷酸化,但对rhHMGB1诱导的MAPKs
磷酸化无明显抑制作用。结论瑞香素能够抑制HMGB1释放及其诱发的炎症反应,而且瑞香素可能通过抑制JAK-STAT1信号
途径减弱HMGB1的释放。
     

内质网应激对巨噬细胞类泛素折叠修饰蛋白Ufm1表达的影响

目的 探讨内质网应激(ERS)对巨噬细胞类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)表达的影响.方法 制备搪尿病模型小鼠(db/db鼠,糖尿病组,n=6)和同窝野生型(WT) C57小鼠(对照组,n=6)的原代腹腔巨噬细胞,采用Real-Time PCR技术检测ERS相关分子( GRP78、XBP1)及Ufm1 mRNA的表达.分别用8μg/mL衣霉素(TM)、0.5 μmol毒胡萝卜素(TG)和0.8 μmol TG诱导小鼠-单核巨噬细胞系RAW264.7,采用Real-Time PCR技术检测GRP78、XBP1和Ufm1 mRNA的表达,采用Western blotting法检测ERS相关因子(p-eIf2α、eIf2α、CHOP)及Ufm1蛋白的表达.结果 糖尿病组小鼠腹腔巨噬细胞GRP78、XBP1和Ufm1 mRNA的表达量均显著高于对照组(均P ＜0.001).经TM或TG诱导的RAW264.7细胞中Ufm1 mRNA和蛋白的表达量均明显高于阴性对照细胞(P＜0.05).结论 糖尿病小鼠腹腔巨噬细胞中ERS相关因子及Ufm1的表达同时升高.体外诱导巨噬细胞株ERS能导致Ufml的表达升高;提示Ufm1可能部分通过ERS途径影响巨噬细胞功能而参与糖尿病动脉粥样硬化过程.     

脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎性反应中前列腺素E2/前列腺素E受体4调控高迁移率族蛋白1的机制

目的：探讨前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠腹腔巨 噬细胞高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)表达的影响及其可能的机制。 方法：运用常规 方法提取、培养小鼠腹腔巨噬细胞;采用LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞构建炎症模型;使用PGE2和前列腺素E受体 (prostaglandin E receptor,EP)激动剂 、RNAi技术下调巨噬细胞EP4受体表达、抑制性表达DN.CREB质粒处理LPS诱导的 小鼠腹腔巨噬细胞,并通过Western印迹测定HMGB1表达水平。结果：与单纯应用LPS处理巨噬细胞比较,PGE2联合 LPS共孵育小鼠腹腔巨噬细胞24 h后,HMGB1蛋白的表达水平明显上升,且EP4受体激动剂联合LPS处理小鼠腹腔巨 噬细胞24 h后HMGB1蛋白的表达亦增加(均P<0.05);与PGE2+LPS联合处理比较,应用RNAi技术可下调小鼠腹腔巨噬 细胞EP4受体表达,再给予外源性PGE2加LPS处理,HMGB1水平下降(P<0.05);使用DN.CREB质粒抑制cAMP结合元 件结合蛋白(cAMP respondse element bound protein,CREB)后再加上EP4受体激动剂联合LPS处理,与EP4受体激动剂+ LPS处理比较,HMGB1水平差异无统计学意义(P>0.05);与单纯应用LPS 比较,EP4受体激动剂联合LPS处理小鼠腹 腔巨噬细胞可上调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,亦 称Akt)thr308磷酸化水平(均P<0.05);使用EGFR抑制剂预处理细胞后,Akt thr308磷酸化水平及HMGB1表达均降低(均 P<0.05);采用Akt特异性抑制剂预处理细胞后,HMGB1表达降低(P<0.05)。结论：PGE2可以通过EP4受体上调LPS诱 导的小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1的表达,且这一作用与激活EGFR/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路有关。     

苦柯胺B拮抗细菌内毒素和CpG DNA的实验研究

目的观察中药活性成分苦柯胺B(kukoamine B,KB)体内外拮抗脓毒症的药理活性。方法采用双偏振极化干涉测量技术测定KB与大肠埃希氏菌LPS、CpG ODN 1826的亲和力,并用鲎试剂法检测KB对大肠埃希氏菌LPS的体外中和作用,采用ELISA法体外检测KB对LPS和CpG DNA单独刺激RAW 264.7细胞释放炎症介质TNF-α和IL-6的抑制作用,ELISA法检测热灭活大肠埃希菌和热灭活金黄色葡萄球菌刺激RAW 264.7细胞释放炎症介质TNF-α和IL-6的抑制作用。在腹腔注射热灭活细菌菌液小鼠脓毒症模型中,将BALB/c小鼠分为对照组、KB(低、中、高剂量)组、和临床药物组(血必净和乌司他丁),观察比较7 d内各组动物死亡率。结果 KB与LPS和CpG ODN1826的KD值分别为7.38 nmol/L和197.2 nmol/L,在体外KB能够明显抑制LPS对鲎试剂的促凝作用(P<0.05,P<0.01),对热灭活细菌刺激RAW 264.7细胞释放TNF-α和IL-6具有显著的抑制作用,并呈现明确的量效关系(P<0.05,P<0.01)。在体内实验中,KB对重度和极重度脓毒症模型均具有明确的保护作用,KB组小鼠生存率显著高于对照组和临床药物组(P<0.05,P<0.01)。结论 KB作为一种多病原分子的中和剂,能够抑制炎症介质的释放,发挥对脓毒症模型小鼠的保护作用,且效果显著优于现有临床用药血必净和乌司他丁。     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

清火败毒饮对巨噬细胞高迁移率族蛋白1表达的影响

目的：观察中药清火败毒饮方（qinghuobaiduyin,QHBDY）对晚期炎症因子高迁移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1,HMGB1）在RAW264.7巨噬细胞中表达的影响,以了解其抗炎症反应的细胞内源性保护机制。方法：以RAW264.7巨噬细胞为研究对象,通过正常SD大鼠血清、烧伤SD大鼠血清和中药QHBDY治疗后SD大鼠血清干预细胞,应用RT-PCR技术检测细胞中HMGB1表达。结果：正常SD大鼠血清干预RAW264.7巨噬细胞后,HMGB1 mRNA的表达量与正常RAW264.7巨噬细胞中HMGB1表达量差异无统计学意义（P＞0.05）;应用烧伤SD大鼠血清干预RAW264.7巨噬细胞,HMGB1的表达量在干预3 h增高后又降为低水平表达,至18 h后急剧增加,于36 h达到高峰,至48 h仍维持高水平表达;应用中药QHBDY治疗后SD大鼠血清干预RAW264.7巨噬细胞,HMGB1的表达量在干预3 h增高后又降为低水平表达,于24 h出现缓慢增加,但较烧伤SD大鼠血清干预组低,两组差别具有统计学意义（P＜0.05）。结论：烧伤血清能引起HMGB1在RAW264.7中的高表达;中药QHBDY治疗后SD大鼠血清能降低RAW264.7中HMGB1的表达     

青藤碱通过调节血红素氧合酶-1表达和自噬抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症

目的：探讨青藤碱对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症的影响和机制。方法：以小鼠RAW264.7巨噬 细胞为研究对象,在有或无血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抑制剂Znpp处理下,采用青藤碱和/或脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)处理RAW264.7巨噬细胞。应用Real-time PCR检测细胞炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA表达, ELISA检测细胞炎症因子TNF-α和IL-6水平,免疫荧光试验分析细胞自噬情况,Western印迹检测细胞HO-1蛋白表达。 结果：与对照组相比,LPS作用后RAW264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达和释放增多,自噬相关蛋白LC3绿色荧光 聚集,HO-1表达水平升高(P<0.05);与LPS组相比,加用青藤碱处理能减少TNF-α和IL-6表达和释放,进一步促进LC3 绿色荧光聚集,增加HO-1水平(P<0.05);用HO-1抑制剂Znpp预处理后,青藤碱对LPS诱导TNF-α和IL-6表达和释放的 抑制作用减弱,LC3绿色荧光聚集减少(P<0.05)。结论：青藤碱能减轻LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症,其机制可 能与HO-1介导的自噬激活有关,这为青藤碱应用于炎症反应的防治提供了实验基础和理论依据。     

Atorvastatin Attenuates TNF-alpha Production via Heme Oxygenase-1 Pathway in LPS-stimulated RAW264.7 Macrophages

Objective To assess the effect of atorvastatin on lipopolysaccharide(LPS)-induced TNF-α production in RAW264.7 macrophages. Methods RAW264.7 macrophages were treated in different LPS concentrations or at different time points with or without atorvastatin. TNF-α level in supernatant was measured. Expressions of TNF-α mRNA and protein and heme oxygenase-1(HO-1) were detected by ELISA, PCR, and Western blot, respectively. HO activity was assayed. Results LPS significantly increased the TNF-α expression and secretion in a dose- and time-dependent manner. The HO-1 activity and HO-1 expression level were significantly higher after atorvastatin treatment than before atorvastatin treatment and attenuated by SB203580 and PD98059 but not by SP600125, suggesting that the ERK and p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK) pathways participate in regulating the above-mentioned effects of atorvastatin. Moreover, the HO-1 activity suppressed by SnPP or the HO-1 expression inhibited by siRNA significantly attenuated the effect of atorvastatin on TNF-α expression and production in LPS-stimulated macrophages. Conclusion Atorvastatin can attenuate LPS-induced TNF-α expression and production by activating HO-1 via the ERK and p38 MAPK pathways, suggesting that atorvastatin can be used in treatment of inflammatory diseases such as sepsis, especially in those with atherosclerotic diseases.     

PGRN缺失型腹膜巨噬细胞对细菌脂多糖的体外炎症应答

目的   观察颗粒蛋白前体(PGRN)对细菌脂多糖(LPS)诱导腹膜巨噬细胞(PM)炎症应答的影响。方法   诱导提取野生型(WT)小鼠及PGRN基因敲除小鼠(KO)腹膜细胞(PEC),观察PEC数目、形态和类型;流式细胞术检测PEC的巨噬细胞表面标志物CD11b、F4/80。LPS分别处理WT或KO小鼠PM,LPS、重组PGRN或LPS加重组PGRN分别处理WT小鼠PM,培养24h后收集细胞上清,ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素12(IL-12),Griess法检测一氧化氮(NO)。 结果   PGRN缺失对小鼠PEC的数目、成分及巨噬细胞表面标志物CD11b、F4/80的表达无明显影响;与WT组相比,LPS诱导PGRN KO来源的PM分泌较高水平的TNF-α、IL-1β、IL-12及NO。外源给予重组PGRN后,LPS诱导WT组PM分泌TNF-α、IL-1β、IL-12及NO的水平降低。结论   PGRN缺失使PM对LPS的刺激产生了更强的炎症反应;外源性给予重组PGRN则可抑制LPS诱导PM 释放前炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-12及炎症介质NO。     

丙酮酸乙酯抑制脓毒症时HMGB1释放的分子机制

【目的】 探讨丙酮酸乙酯(EP)抑制脓毒症巨噬细胞表达和释放HMGB1的相关分子机制?【方法】将小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7分为LPS和LPS+ EP组,分别采用100 ng/mL LPS和100 ng/mL LPS+ 5 mmol/L EP刺激,于刺激后不同的时间点,Western blot检测细胞总蛋白内p-p38MAPK?CBP的含量变化以及胞质和胞核内NF-κB的含量;用免疫细胞化学?激光共聚焦显微镜观察培养细胞内p-p38MAPK?NF-κB和CBP的变化;Real-time PCR检测培养细胞HMGB1的mRNA水平,ELISA检测培养上清HMGB1的蛋白含量?【结果】 LPS和LPS+ EP刺激后2~6 h,细胞内p-p38MAPK蛋白含量逐渐增加,但LPS+ EP组p-p38MAPK蛋白含量明显低于LPS组;NF-κB在细胞质内的含量逐渐减少,而在细胞核内的含量逐渐增多,而LPS+ EP组NF-κB从胞质到胞核的移位明显弱于LPS组;细胞内CBP的蛋白含量逐渐增加,但LPS+ EP组明显低于LPS组?随着p-p38MAPK?NF-κB和CBP等蛋白的变化,LPS和LPS+ EP刺激后24?36和48 h,LPS+ EP组细胞内HMGB1 mRNA表达比LPS组明显减少;在LPS和LPS+ EP刺激后18~48h,LPS+ EP组培养上清中HMGB1蛋白含量明显低于LPS组?【结论】 EP通过抑制单核-巨噬细胞内的信号分子p-p38MAPK?NF-κB?和 CBP的表达,从而抑制LPS诱导单核-巨噬细胞表达和释放HMGB1?     

毛樱桃总黄酮对RAW264.7细胞中炎症因子水平的影响及其机制

目的：探讨毛樱桃总黄酮（PTTTF）对脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型中炎症因子的影响,阐明其作用机制。方法：通过LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7和人中性粒细胞（PMN）建立细胞炎症模型,将细胞分为对照组、模型组、地塞米松（DXM）组和不同剂量（0.4、4.0和40.0 mg·L^-1）PTTTF组。采用RT-PCR法检测RAW264.7细胞中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA表达水平;采用Western blotting法检测RAW264.7细胞中核转录因子κB（NF-κB）及信号通路关键分子细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、C-Jun氨基末端激酶1/2（JNK）和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平;采用流式细胞术检测RAW264.7细胞S期细胞百分率和PMN细胞凋亡率。结果：与对照组比较,模型组RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α和HMGB1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,S期细胞百分率明显升高（P<0.05）,PMN细胞凋亡百分率明显降低（P<0.05）。与模型组比较,4.0及40.0 mg·L^-1PTTTF组和DXM组RAW264.7细胞中IL-1β、iNOS、TNF-α和HMGB1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）,NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,S期细胞百分率明显降低（P<0.05或P<0.01）,PMN细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：PTTTF能够下调LPS诱导的细胞炎症模型中炎症因子表达水平,该作用可能与其降低S期细胞百分率,促进其凋亡,并下调NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达有关。     

右美托咪定对脓毒症大鼠高迁移率族蛋白 B1 的作用

目的：探讨右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)对脓毒症大鼠血液和脾组织中高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)的作用及其可能的机制。方法：将100只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、DEX组、α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin-tetramethylrhodamine,α-BGT)+DEX组和α-BGT组,每组20只。对照组静脉注射等量的生理盐水,其余各组均通过静注内毒素(lipopolysaccharide,LPS)构建脓毒症模型,并给予不同的处理,48h后处死大鼠,留取血液及脾组织标本。应用ELISA分别检测血液中TNF-α和晚期炎症介质HMGB1的水平,Western印迹检测脾组织中HMGB1的含量。结果：5组大鼠间病死率、血清TNF-α水平、HMGB1的血清水平和脾组织含量差异均有统计学意义(均P<0.05),且HMGB1的血清水平和脾组织含量存在显著相关性(r=0.863,P<0.05)。结论：DEX可明显降低脓毒症大鼠血液及脾组织中晚期炎症介质HMGB1的含量,这种作用可能是通过激活胆碱能抗炎通路而实现的。     

脂多糖诱导膀胱癌细胞释放HMGB1及其机制研究

目的研究脂多糖（LPS）对膀胱癌细胞高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放的诱导作用,并探讨其可能的机制。方法采用人膀胱癌细胞株T24,观察100μg/L LPS诱导不同时间对培养上清液中HMGB1含量和细胞HMGB1 mRNA表达水平的变化,及不同浓度的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路抑制剂LY294002对HMGB1释放的作用。分别使用酶联免疫吸附试验、荧光定量PCR法检测HMGB1含量和HMGB1mRNA表达水平。结果培养上清液中HMGB1含量和细胞HMGB1 mRNA表达水平均于LPS诱导12 h后升高,并随诱导时间延长而进一步升高。LY294002对LPS诱导HMGB1释放有不完全的抑制作用。结论 LPS诱导膀胱癌细胞释放HMGB1,其机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、IL-10表达的影响

目的 研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW 264.7细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6及抗炎性细胞因子IL-10的动态变化规律及八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK.-8)对其表达的影响.方法 LPS诱导RAW 264.7细胞不同时间(0、...     

金盏花苷E通过ROS介导的JAK1-stat3信号途径抑制LPS诱发的炎症反应

目的探讨金盏花苷E对脂多糖（LPS）诱导炎症反应的抑制作用及可能的分子机制。方法CCK-8实验检测不同浓度（0、 2、4、6、8、10、20、25、30 μg/mL）的金盏花苷E对RAW264.7 细胞活力的影响;不同浓度的金盏花苷E（0、6、8、10 μg/mL）预处理 RAW264.7细胞2 h,然后用LPS（100 ng/mL）刺激细胞特定的时间,ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β释放;Western blotting检 测iNOS、COX-2的表达水平及JAK-stats、MAPKs及NF-кB信号途径的磷酸化;ROS检测试剂盒检测RAW264.7 细胞内ROS含 量;激光共聚焦实验检测转录因子stat3的核转位。结果CCK-8结果显示,金盏花苷E浓度在低于20 μg/mL时对RAW264.7细 胞无明显毒性作用;金盏花苷E浓度依赖性地下调LPS诱导的iNOS和COX-2的表达（P<0.01 vs LPS组）;抑制LPS诱导的促炎 细胞因子TNF-α及IL-1β的释放,且1 0 μg/mL组抑制作用尤为显著（P<0.01 vs LPS组）;抑制LPS诱导的JAK1-stat3信号途径激 活及stat3的核转位;降低LPS诱发的ROS产生（P<0.01 vs LPS组）。结论金盏花苷E通过抑制ROS介导的JAK1-stat3信号途 径,抑制LPS诱导的炎症反应。     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导小鼠巨噬细胞增殖及TNF-α、TGF-β1的表达

目的探讨日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）对小鼠巨噬细胞株RAW264.7增殖及TNF-α、TGF-β1表达的影响。方法实验分三组：RAW264.7对照组、SEA组和细菌脂多糖（LPS）对照组。培养巨噬细胞株RAW264.7,用20μg/ml SEA分别作用巨噬细胞3、6、9、12和15 h后,荧光定量PCR检测炎症因子TNF-αmRNA和TGF-β1 mRNA的表达;倒置显微镜观察SEA作用12 h后巨噬细胞的形态;Western blot检测炎症相关蛋白TNF-α和TGF-β1的表达;MTT比色法检测SEA对细胞增殖的影响。结果 SEA作用RAW264.7细胞3 h起,TNF-αmR-NA和TGF-β1 mRNA的表达逐渐增高,在第12 h时,其相对表达倍数分别达23.07±3.172和9.83±1.45,与其他各时间点比较差异均有统计学意义（均P〈0.05）;SEA作用12 h巨噬细胞体积明显增大,细胞拉长且形态不规则;SEA作用巨噬细胞24、48、72 h时,A_（490）值分别与RAW264.7对照组相比,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）,而与LPS组的差异无统计学意义（P〉0.05）;在SEA作用RAW264.7细胞12 h时,TNF-α和TGF-β1蛋白表达均高于RAW264.7对照组（均P〈0.05）。结论 SEA能促进巨噬细胞的增殖并诱导TNF-α和TGF-ββ1的表达。     

高迁移率族蛋白1诱导内皮细胞释放细胞因子的作用及其与脂多糖对白细胞介素6释放的协同效应

目的观察高迁移率族蛋白1(HMGB1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响及其对脂多糖(LPS)诱导细胞因子白细胞介素6(IL-6)表达的作用。方法用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测重组HMGB1蛋白(15ng/ml)诱导HUVEC11种细胞因子/趋化因子的水平变化;检测不同浓度HMGB1(0~75ng/ml)刺激后不同时间点(0、1、3、6、12和24h)HUVEC分泌IL-6的水平以及HMGB1(15ng/ml)与LPS(10ng/ml)共同刺激对HUVEC分泌IL-6的影响。结果HMGB1刺激后HUVEC分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的水平明显升高(均P<0.01),分别是对照(未加刺激)的5.7、4.2、27.8、12.8和5.4倍;HMGB1蛋白以时间和剂量依赖方式诱导IL-6的分泌,在刺激后3~6h,IL-6水平开始增加,在6h时IL-6由对照的32pg/ml±21pg/ml增加到75pg/ml±22pg/ml(P<0.01),12h(453pg/ml±78pg/ml)~24h(901pg/ml±184pg/ml)持续升高(P<0.01);随着HMGB1浓度的增加,IL-6的水平也明显增加,当HMGB1浓度为3、15、75ng/ml时,IL-6分别是155pg/ml±33pg/ml、901pg/ml±184pg/ml、1508pg/ml±378pg/ml,与基础值32pg/ml±21pg/ml相比,差异有统计学意义(P<0.01)。分别用LPS(10ng/ml)和HMGB1(15ng/ml)单独刺激HUVEC时,IL-6的含量从基础的32pg/ml±22pg/ml分别增加至289pg/ml±42pg/ml和901pg/ml±184pg/ml(均P<0.01);如果用二者共同刺激HUVEC,IL-6的生成量大大增加(2361pg/ml±299pg/ml),二者存在协同作用(F=69.405,P<0.01)。结论HMGB1蛋白可诱导HUVEC释放多种炎性细胞因子;HMGB1诱导IL-6的上调具有时效性和量效性关系,并可协同LPS刺激HUVEC释放IL-6,在脓毒症的发生和发展中起重要作用。