活化T细胞核因子2 可抑制高迁移率蛋白1 的释放

目的探讨活化T细胞核因子2（NFAT2）对炎症因子高迁移率蛋白1（HMGB1）释放的抑制效应。方法观察脂多糖刺激可
增加HMGB1向胞外释放,在脂多糖刺激的不同时间点收集细胞及其培养上清,应用蛋白印迹法及酶联免疫法检测细胞内及培
养上清中HMGB1蛋白水平的变化;另一方面,探讨脂多糖刺激对NFAT2与HMGB1在胞浆中的结合的影响,在脂多糖刺激的
不同时间点收集THP-1细胞,提取蛋白后应用免疫共沉淀观察二者的结合情况;应用小RNA干扰技术抑制NFAT2的表达,检测
对HMGB1 合成释放的影响。结果脂多糖刺激THP-1 细胞时间越长,细胞培养上清的HMGB1 浓度增加,而细胞浆内与
NFAT2 结合的HMGB1 水平下降,细胞核内没有检测到二者的相互作用。NFAT2 的小RNA干扰质粒转染后,THP-1 细胞内
NFAT2浓度下降,同时细胞上清中HMGB1的水平上升。结论NFAT2可抑制HMGB1的合成释放。
     

枫叶黄酮抑制脂多糖诱导破骨前体细胞Raw264.7细胞激活的作用

目的 探讨枫叶黄酮对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导破骨前体细胞Raw264.7细胞炎性因子释放的抑制作用.方法 用LPS(5 mg/mL刺激Raw264.7细胞构建炎症模型,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测Raw264.7细胞的活力影响;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测一氧化氮(N0)和前列腺素E2,PGE2表达;运用免疫荧光染色方法 检测诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2,COX-2、子肿瘤坏死因子-αTNF-α和白介素-1β,IL-1β、核因子-κB,NF-κB蛋白与mRNA的表达变化.结果 不同浓度的枫叶黄酮明显抑制了LPS诱导的Row246.7细胞NO、PGE2,iNOS和COX-2,TNF-α和IL-1β与NF-κB的上调,并且.NO、PGE2、iNOS、COX-2和NF-κB蛋白的表达呈剂量依赖性.结论 枫叶黄酮可抑制LPS诱导的破骨前体细胞Raw264.7细胞iNOS、COX-2和NF-κB/P65蛋白表达和炎性因子释放从而抑制破骨细胞的激活.     

COX/5-LOX双重抑制剂ZLJ-6对脂多糖诱导下巨噬细胞炎症因子表达的影响

研究COX/5-LOX双重抑制剂ZLJ-6对脂多糖(LPS)诱导下RAW 264.7细胞炎症模型的抗炎作用。采用LPS (1μg/mL)刺激生长良好的RAW 264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型,在不同浓度的ZLJ-6( 3,10,30 μmol/L)作用下,用Griess法检测细胞培养液中NO的含量,用ELISA法检测TNF-α、IL-6含量,并用Western blotting检测各组细胞中环加氧酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮激酶(iNOS) 的表达。ZLJ-6能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的释放以及TNF-α、IL-6等炎症因子的生成,同时抑制COX-2和iNOS的表达。结果表明,ZLJ-6具有抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的作用,其抗炎机制可能通过抑制COX-2、iNOS的表达以及炎症介质NO以及TNF-α、IL-6的产生。     

金盏花苷E通过ROS介导的JAK1-stat3信号途径抑制LPS诱发的炎症反应

目的探讨金盏花苷E对脂多糖（LPS）诱导炎症反应的抑制作用及可能的分子机制。方法CCK-8实验检测不同浓度（0、 2、4、6、8、10、20、25、30 μg/mL）的金盏花苷E对RAW264.7 细胞活力的影响;不同浓度的金盏花苷E（0、6、8、10 μg/mL）预处理 RAW264.7细胞2 h,然后用LPS（100 ng/mL）刺激细胞特定的时间,ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β释放;Western blotting检 测iNOS、COX-2的表达水平及JAK-stats、MAPKs及NF-кB信号途径的磷酸化;ROS检测试剂盒检测RAW264.7 细胞内ROS含 量;激光共聚焦实验检测转录因子stat3的核转位。结果CCK-8结果显示,金盏花苷E浓度在低于20 μg/mL时对RAW264.7细 胞无明显毒性作用;金盏花苷E浓度依赖性地下调LPS诱导的iNOS和COX-2的表达（P<0.01 vs LPS组）;抑制LPS诱导的促炎 细胞因子TNF-α及IL-1β的释放,且1 0 μg/mL组抑制作用尤为显著（P<0.01 vs LPS组）;抑制LPS诱导的JAK1-stat3信号途径激 活及stat3的核转位;降低LPS诱发的ROS产生（P<0.01 vs LPS组）。结论金盏花苷E通过抑制ROS介导的JAK1-stat3信号途 径,抑制LPS诱导的炎症反应。     

消退素D1抑制内毒素诱导大鼠原代肺成纤维细胞环氧合酶-2及前列腺素E2表达的研究

目的 探讨消退素D1对原代肺成纤维细胞(LF)环氧合酶-2(COX-2)及前列腺素E2(PGE2)表达的影响.方法 分离、纯化、鉴定得到LF,用内毒素(LPS)干预建立成纤维细胞体外急性炎症模型,并利用细胞增殖/毒性检测试剂MTT检测出成纤维细胞急性炎症模型的最适LPS浓度和药物干预时间.分别应用不同浓度(0、10、50及100 nmol/ml)的消退素D1作用于经过LPS诱导的体外培养原代LF.采用酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液PGE2水平,同时应用Western-blot检测原代LF COX-2蛋白的表达.结果 用1μg/ml LPS干预体外培养的原代LF6h能建立较为合理的急性炎症模型.消退素D1能抑制LPS诱导的原代LF COX-2蛋白的表达及上清液PGE2水平,并呈剂量依赖性.结论 消退素D1能抑制LPS诱导的原代LF COX-2及PGE2的表达.     

白杨素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗炎和抗氧化作用:基于蛋白质芯片方法

目的 探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在白杨素抗炎抗氧化作用中的机制。方法 分别用0、5、10、15、30、60、120、240 μg/mL白杨素处理RAW264.7细胞24 h后,CCK-8法检测细胞活力。用白杨素预处理细胞2 h,加入脂多糖（100 ng/mL）分别刺激0、10、30 min,1、2、4、8、16 h,运用蛋白质芯片进行相关信号分子的筛选。用白杨素（10、30、60 μg/mL）孵育细胞2 h后,加入脂多糖刺激18 h,ELISA法检测IL-6,MCP-1和TNF-α的释放量;Griess法检测NO浓度;DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平。设立空白对照组,白杨素（60 μg/mL）单独处理组,脂多糖（100 ng/mL）单独刺激组,以及白杨素和脂多糖联合处理组,RT-PCR法检测iNOS和COX-2的mRNA的表达量。分别用脂多糖（100 ng/mL）,N-乙酰-半胱氨酸（NAC）（20 μmol/L）或白杨素（10、30、60 μg/mL）单独或共处理细胞后,用Western blot检测炎症相关通路p-AKT、p-PRAS40、p-mTOR、mTOR、p-P70S6k、p-S6RP、 S6RP的表达水平。结果 白杨素剂量在60 μg/mL内,对细胞活力基本无影响（P>0.05）;白杨素能够降低脂多糖刺激诱导的IL-6,MCP-1,TNF-α和炎症介质NO的释放量（P<0.01）,抑制iNOS和COX-2的蛋白表达量和mRNA的表达水平（P<0.01）;蛋白质芯片筛选结果提示,脂多糖能够激活AKT/mTOR信号通路,而白杨素抑制其信号分子的活化,Western blot结果进一步验证了蛋白质芯片的结果（P<0.01）;白杨素显著下调内源性ROS的生成;运用NAC清除细胞内ROS后,炎症蛋白iNOS和COX-2的表达量下调（P<0.05）,而AKT/mTOR通路的活化被阻断（P<0.05）。结论 白杨素通过抑制上游信号分子ROS的合成,进而抑制AKT/mTOR信号通路的活化,调控核糖体的翻译过程,下调促炎细胞因子和炎症介质的合成和释放,发挥抗炎作用。     

粉防己碱对脂多糖诱导下RAW264.7细胞COX-2/PGE2、iNOS/NO表达的影响

本实验旨在观察粉防己碱（Tet）对脂多糖（LPS）诱导下RAW264.7细胞炎症模型的抗炎作用。采用 LPS 1 μg/mL刺激生长良好的RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型。在不同浓度Tet（1×10^-8,1×10^-7,1×10^-6mol/L）作用下,用Western blotting检测各组细胞中环加氧酶-2（COX-2）和诱导性一氧化氮激酶（iNOS）的表达,用NO检测试剂盒检测细胞培养液中NO的含量,酶免疫分析法检测培养液中前列腺素E₂（PGE₂）含量。结果显示Tet剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞PGE₂、NO的表达,同时抑制其合成酶COX-2和iNOS的表达。表明Tet具有抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的作用,其抗炎机制可能通过抑制COX-2、iNOS的表达,从而抑制其下游炎性介质NO、PGE₂的表达有关。     

氯硝柳胺抑制小胶质细胞炎症作用研究

目的:探讨氯硝柳胺对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞炎症作用的影响。方法:建立脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞系BV2炎症反应模型;采用Griess法检测细胞上清中NO释放量,MTT法检测细胞活性;实时定量PCR(qPCR)检测促炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的表达量。分析氯硝柳胺对小胶质细胞炎症的影响。结果:氯硝柳胺能够显著抑制LPS激活的BV2细胞中NO释放量;qPCR结果显示,与正常细胞组相比,LPS组BV2中促炎因子的表达水平明显升高;氯硝柳胺显著降低LPS诱导的BV2细胞中促炎因子表达。结论:氯硝柳胺对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应有明显抑制作用。     

牡荆素对肺泡上皮细胞HMGB1/RAGE通路及炎症损伤的影响

目的探讨牡荆素对肺泡上皮细胞高迁移率族蛋白1(HMGB1)/晚期糖基化终产物受体(RAGE)通路及炎症损伤的影响。方法体外培养人肺泡上皮细胞HPAEpiC,分为对照组(不进行处理)、脂多糖组(10μg/mL脂多糖)、低浓度组(10μg/mL脂多糖+20μmol/L牡荆素)和高浓度组(10μg/mL脂多糖+60μmol/L牡荆素)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组HPAEpiC细胞中HMGB1、RAGE mRNA表达情况;蛋白印迹(WB)法检测各组HPAEpiC细胞中HMGB1、RAGE蛋白表达情况;MTT法检测各组HPAEpiC细胞增殖情况;酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组HPAEpiC细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果与对照组比较,脂多糖组HPAEpiC细胞中HMGB1、RAGE mRNA及蛋白表达水平显著升高(mRNA:tHMGB1=14.269、tRAGE=17.554,蛋白:tHMGB1=19.200、tRAGE=18.887,P均0.05),细胞活力显著减弱(t=10.314,P0.05),细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著升高(t=45.731、64.827、46.063,P均0.05);与脂多糖组比较,随着牡荆素的使用及浓度的升高,HPAEpiC细胞中HMGB1、RAGE mRNA及蛋白表达水平显著降低(P均0.05),细胞活力显著增强(P均0.05),细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著降低(P均0.05)。结论牡荆素可能通过抑制HMGB1/RAGE通路,减轻脂多糖诱导的肺泡上皮细胞炎症损伤。     

JAK/STAT通路在脂多糖诱导肝细胞HMGB1释放中的作用

目的:探讨Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)信号通路在内毒素脂多糖诱导肝细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放中的作用?方法:观察100 μg/L 脂多糖诱导后,大鼠肝细胞BRL-3A细胞HMGB1 mRNA表达水平和细胞培养上清液中HMGB1含量的变化,及不同浓度的JAK/STAT通路抑制剂tyrphostin AG 490?氟达拉滨的影响?结果:脂多糖诱导BRL-3A细胞24 h后HMGB1 mRNA表达水平和培养上清液中HMGB1含量明显升高(P < 0.01),25 μmol/L tyrphostin AG 490和50 μmol/L氟达拉滨对以上2个指标显示一定程度的抑制作用(P < 0.05)?结论:内毒素脂多糖可诱导肝细胞HMGB1的表达和释放,其机制可能与细胞JAK/STAT信号通路有关?     

HMGB1对人鼻咽癌细胞株C666-1体外增殖的影响

目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人鼻咽癌细胞株C666-1增殖的影响并探讨其可能的机制。方法用siRNA干扰
鼻咽癌细胞株C666-1 HMGB1基因,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测cyclin D1,CDK6及相
关通路蛋白表达。用带GFP的HMGB1质粒转染鼻咽癌细胞株C666-1,EDU和CCK-8检测细胞增殖。结果干扰HMGB1的表
达后,细胞增殖明显减慢（P<0.001）;细胞周期分析显示处于G1期细胞比例增多（P<0.001）,S期细胞比例明显下降（P<0.001）;
Western blot结果显示cyclin D1、CDK6的表达下调,STAT3,P-STAT3的表达也下调。过表达HMGB1后,EDU显示处于S期细
胞比例增多（P<0.05）;CCK-8显示细胞增殖明显增快（P<0.001）。结论HMGB1促进人鼻咽癌细胞株C666-1的增殖,可能通过
STAT3信号通路上调cyclin D1、CDK6促进鼻咽癌细胞株C666-1由G1期进入S期从而调控其增殖。
     

LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究

目的:观察LPS诱导RAW264.7细胞内HMGBl转位及其释放.方法:用不同浓度的LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h,用荧光显微镜观察LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1的分布情况.用West-ern blot方法检测HMGB1在胞核及培养上清中的水平.结果:LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h后,培养上清中的HMGB1水平明显增加,胞核HMGBl含量减少,并存在剂量依赖关系.结论:LPS能诱导RAW264.7细胞释放HMGB1,存在剂量依赖关系.     

异丹叶大黄素对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的影响

目的 探究异丹叶大黄素(ISO)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用及潜在机制。方法 体外培养RAW264.7细胞,采用不同浓度ISO处理细胞,CCK-8法检测细胞活力。使用200 ng/ml LPS诱导RAW264.7细胞,以ISO、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)进行干预,Western blot检测各组细胞中炎症介质白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、P65、磷酸化P65(p-P65)、IκB、磷酸化IκB(p-IκB)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)、高迁移率组蛋白B1(HMGB1)以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、P62的表达,DCFH-DA探针检测各组细胞内活性氧(ROS)的变化。采用腹腔注射LPS(15 mg/kg)方法构建小鼠ALI模型,HE染色观察各组肺组织形态的病理变化,Western blot检测各组肺组织中炎症介质和自噬相关蛋白的表达,流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中ROS的含量。结果 ISO可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、HMGB1的表达,抑制ROS的产生,促进LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达,降低P62的表达,激活自噬通路(P均<0.05);当使用自噬抑制剂3-MA干预后可显著增加p-P65/P65、p-IκB、iNOS、COX-2、HMGB1的表达且降低IκB的表达(P均<0.001),并促进ROS的产生。ISO能够改善LPS诱导的ALI小鼠的肺组织病理变化,显著抑制肺组织中p-P65/P65、p-IκB、iNOS、COX-2、HMGB1的表达且促进IκB的表达(P均<0.001),减少BALF中ROS的含量,3-MA则会逆转ISO的保护作用。结论 ISO对LPS诱导的ALI小鼠具有保护作用,其机制可能与ISO激活巨噬细胞自噬有关。     

毛樱桃总黄酮对RAW264.7细胞中炎症因子水平的影响及其机制

目的：探讨毛樱桃总黄酮（PTTTF）对脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症模型中炎症因子的影响,阐明其作用机制。方法：通过LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7和人中性粒细胞（PMN）建立细胞炎症模型,将细胞分为对照组、模型组、地塞米松（DXM）组和不同剂量（0.4、4.0和40.0 mg·L^-1）PTTTF组。采用RT-PCR法检测RAW264.7细胞中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA表达水平;采用Western blotting法检测RAW264.7细胞中核转录因子κB（NF-κB）及信号通路关键分子细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、C-Jun氨基末端激酶1/2（JNK）和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平;采用流式细胞术检测RAW264.7细胞S期细胞百分率和PMN细胞凋亡率。结果：与对照组比较,模型组RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α和HMGB1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,S期细胞百分率明显升高（P<0.05）,PMN细胞凋亡百分率明显降低（P<0.05）。与模型组比较,4.0及40.0 mg·L^-1PTTTF组和DXM组RAW264.7细胞中IL-1β、iNOS、TNF-α和HMGB1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）,NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,S期细胞百分率明显降低（P<0.05或P<0.01）,PMN细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：PTTTF能够下调LPS诱导的细胞炎症模型中炎症因子表达水平,该作用可能与其降低S期细胞百分率,促进其凋亡,并下调NF-κB、ERK1/2和p-JNK蛋白表达有关。     

氧化苦参碱对脂多糖诱导的RAW264.7细胞一氧化氮及其诱导型合酶表达的影响

目的：观察氧化苦参碱（OMT））对脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7细胞一氧化氮（NO）释放量及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：采用LPS诱导RAW 264.7细胞建立细胞炎症反应模型。实验分组：空白对照组、LPS组（1μg/mL）、OMT组（100μmol/L）、LPS＋OMT小剂量组（20μmol/L）、LPS＋OMT中剂量组（50μmol/L）、LPS＋OMT大剂量组（100μmol/L）。采用Griess试剂法测定细胞培养液中NO释放量。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法测定RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达。结果：OMT显著减少LPS诱导的RAW 264.7细胞NO的释放（P〈0.05,P〈0.01）;同时减少LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达（P〈0.05,P〈0.01）。结论：OMT可能通过抑制LPS诱导的巨噬细胞iNOS mRNA表达,减少NO的释放量而发挥抗炎作用。     

三种成体干细胞对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症状态的影响

目的比较人羊膜上皮细胞（（human amniotic epithelial cell, H-AEC））、羊膜间充质细胞（human amniotic mesenchymal
cell, HA-MSC）和脐带间充质细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC）分泌的细胞因子对脂多糖刺激巨噬细胞
系RAW264.7炎症状态的影响。方法将LPS刺激的RAW264.7细胞炎症模型作为对照组,比较H-AEC、HA-MSC、UC-MSC和
RAW264.7共培养或条件培养基培养RAW264.7对RAW264.7炎症状态的影响。比较各组RAW264.7细胞的迁移能力;检测各
组细胞分泌一氧化氮（NO）的水平;用实时定量多聚酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞经典激活的巨噬细胞（classically
activated macrophage, M1 macrophage）相关的促炎基因如白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死基因а（TNFа）、一氧化氮合成酶-2
（NOS-2）以及M2 macrophage相关的抑炎基因如精氨酸酶（Arg-1）、甘露糖受体基因CD206、B类清道夫受体CD36）表达情况。
结果（1）H-AEC、HA-MSC、UC-MSC 处理后RAW264.7 的迁移率分别为14.7%±4.5%、9.6%±0.7%、13.0%±0.9%,与对照组
（31.1%±11.0%）相比,3 种细胞的条件培养基处理后RAW264.7 的迁移率均降低,差异具有显著性（P<0.05）;（2）H-AEC、
HA-MSC、UC-MSC共培养后RAW264.7 细胞分泌NO的水平分别为24.26±0.72、44.52±2.51、42.25±0.76 μmol/L,与对照组
（45.65±1.78 μmol/L）相比,H-AEC组细胞分泌的NO有显著性下降（P<0.05）;（3）促炎基因与抑炎基因的表达改变：（A）H-AEC
处理组促炎基因IL-1β、TNFа、NOS-2、INFβ的表达下调,与对照组相比有显著差别;HA-MSC、UC-MSC处理组促炎基因INFβ表
达下调显著,其余基因均上调表达;抑炎相关基因如Arg-1、CD206、CD36均上调;（B）3组细胞干预后抑炎症相关基因Arg-1、
CD206、CD36表达均上调,与对照组有显著差异。结论人羊膜上皮细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞可以促进巨噬细
胞向M2型分化,但其效果和机制存在不同。