脂质体方法转染人骨髓基质细胞的影响因素

目的探讨用脂质体介导的方法转染人骨髓基质细胞的影响因素。方法构建真核表达载体pcDNA3-sFlt-1D4，脂质体方法转染人骨髓基质细胞，流式细胞仪检测转染率，ELISA、MTT法检测转基因蛋白sFlt-1D4的浓度及功能。结果转染率为9．27％。ELISA法检测转染后24、48h及4周转基因骨髓基质细胞培养上清中sFlt-1D4蛋白的表达浓度分别为（0．104±0．078）μg／L、（0．158±0．022）μg／L和（0．171±0．069）μ5／L。ELISA法证实转基因组培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）含量降低。MTr法证实转染24、48h及4周的转基因产物对K562细胞的抑瘤率分别为（9．41±4．71）％、（23．63±7．50）％和（33．13±6．93）％。结论血清、细胞铺板密度、转染后细胞筛选的方式等是影响转染质量的主要因素。转基因方法可以获得sFlt-1D4蛋白的表达，转基因蛋白具有抑制K562细胞生长的作用。     

WN-γ基因修饰的骨髓基质细胞体外抗白血病作用的实验研究

目的研究重组人IFNγ腺病毒(Ad/hIFNγ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFNγ表达,并进一步观察转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用。方法以Ad/hIFNγ重组腺病毒按感染复数(MOI)为50转染CML病人骨髓基质细胞,RTPCR、ELISA及Westernblot分别检测转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFNγmRNA和IFNγ的表达;转染Ad/hIFNγ的骨髓基质细胞与K562细胞共培养,通过绘制K562细胞生长曲线分析其对K562细胞增殖的影响;并进一步通过流式细胞学分析其对K562细胞周期的影响和诱导凋亡的作用。结果RTPCR、Westernblot及ELISA方法都分别检测到转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFNγmRNA和IFNγ的表达;与对照组相比,转染Ad/hIFNγ的人骨髓基质细胞的实验组具有明显的抑制K562细胞增殖的作用(P=0.000),在细胞周期G1期的K562细胞比例明显增加,而S期K562细胞比例显著下降(P<0.01),并显著诱导K562细胞的凋亡(P<0.01)。结论Ad/hIFNγ转染人骨髓基质细胞后可获得IFNγ有效的表达,并在体外能有效地发挥抗白血病细胞作用。     

IFN-γ基因修饰的骨髓基质细胞体外抗白血病作用的实验研究

目的研究重组人IFN-γ腺病毒(Ad/hIFN-γ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFN-γ表达,并进一步观察转染Ad/hIFN-γ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用. 方法以Ad/hIFN-γ重组腺病毒按感染复数(MOI)为50转染CML病人骨髓基质细胞,RT-PCR、ELISA及Western blot分别检测转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFN-γ mRNA和IFN-γ的表达;转染Ad/hIFN-γ的骨髓基质细胞与K562细胞共培养,通过绘制K562细胞生长曲线分析其对K562细胞增殖的影响;并进一步通过流式细胞学分析其对K562细胞周期的影响和诱导凋亡的作用.结果 RT-PCR、Western blot及ELISA方法都分别检测到转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFN-γ mRNA和IFN-γ的表达;与对照组相比,转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞的实验组具有明显的抑制K562细胞增殖的作用(P=0.000),在细胞周期G1期的K562细胞比例明显增加,而S期K562细胞比例显著下降(P<0.01),并显著诱导K562细胞的凋亡(P<0.01).结论 Ad/hIFN-γ转染人骨髓基质细胞后可获得IFN-γ有效的表达,并在体外能有效地发挥抗白血病细胞作用.     

shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制.方法:针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1,2,3,采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞,RT-PCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1,MRP1,topoⅡ,GST的mRNA水平;蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平;MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度(IC50值).结果:K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞,差异有统计学意义(P<0.01),且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞;转染shRNA后,K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调,其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义(P<0.05),以shRNA3组下调最显著,并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调;转染48 h后K562/A02细胞中MDR1,MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调,以shRNA3组下调最显著,分别下调(39.7±1.21)%,(29.1±0.97)%,(28.2±1.04)%,GST基因表达则无明显变化;阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加,其中以shRNA3组最显著.结论:VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达,不同干扰片段的沉默效果不同,并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,其机制可能与MDR1,MRP1及topo Ⅱ的表达下调有一定的关系.     

优势表达SphK-1基因对K562细胞生物学特性的影响

目的:了解优势表达鞘氨醇激酶-1(SphK-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞生物学特性的影响。方法:使用pLXSN、pLXSN-SphK-1的重组逆转录病毒液感染K562细胞并用终浓度1 000 ng/m l的G418筛选感染pLXSN和pLXSN-SphK-1基因的K562细胞;取对数生长期的K562-pLXSN和K562-SphK细胞提取蛋白收集胞浆蛋白,应用BCA-200蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。根据蛋白定量取蛋白含量相同的蛋白提取上清行γ3-2P-ATP掺入法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞SphK-1活性;并应用MTT法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞的增殖情况及对不同剂量格列卫的敏感性。结果:K562细胞转染SphK-1基因比转染空载体后的细胞SphK-1酶活性显著增高;K562-pLXSN细胞和K562-SphK细胞培养24 h、48和72 h后细胞增殖无显著性差异;当格列卫浓度为0.1和0.25μmol/L时,K562-PLXSN和K562-SphK细胞培养72 h后的细胞存活率无明显差异;当格列卫浓度为0.5至10μmol/L时,K562-SphK细胞存活率显著低于K562-PLXSN细胞(P<0.05)。结论:优势表达SphK-1基因对K562细胞自然增殖无显著影响,但增加了细胞对浓度高于0.5μmol/L格列卫的敏感性。     

WT1基因特异性siRNA对K562细胞表达及增殖的影响

目的:研究WT1基因特异性小干扰RNA (small RNA interference, siRNA)对K562细胞表达及增殖的影响,为白血病的基因治疗提供新的思路.方法:以慢性粒细胞白血病细胞系-K562为研究对象,化学合成并转染针对K562细胞WT1基因的siRNA,倒置显微镜观察细胞的生长状态及形态学改变;MTT法检测细胞增殖状态;半定量RT-PCR检测siRNA对WT1基因表达的抑制作用;流式细胞仪法检测K562细胞凋亡.结果:siRNA转染K562细胞后, 细胞生长受抑,增殖能力减弱,其增殖抑制作用于转染后48、72 h最明显, 增殖抑制率分别为50.6%和54.1%.半定量RT-PCR显示WT1mRNA表达水平明显低于对照组;WT1 siRNA转染48 h后有42.19 %的K562细胞发生凋亡.结论:WT1基因特异性siRNA可显著抑制K562细胞增殖,促进凋亡,为白血病的基因治疗提供了新的思路.     

SHP1基因诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡及红系分化

目的探讨SHP1基因在诱导K562细胞凋亡及红系分化中的作用。方法应用RT-PCR法克隆SHP1基因全长cDNA序列并克隆于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体转染使其基因在K562细胞中过表达。Hoechst33258染色和FACS(AnnexinⅤ-PI双标)分析检测转基因后K562细胞凋亡;联苯胺蓝染色和血型糖蛋白A(GPA)表达检测分析细胞分化情况。结果 pcDNA3-SHP1转染K562细胞,RT-PCR、蛋白免疫印迹分析证实SHP1在K562细胞中表达。转染48h后,K562细胞出现凋亡,AnnexinⅤ-PI双标FACS分析细胞凋亡率为16.84%,与转染空载体pcDNA3.0(6.23%)相比差异有统计学意义(P=0.000)。联苯胺蓝染色细胞阳性率14.67%,GPA表达率19.38%,与转染空载体组比较差异也有统计学意义(P=0.005)。结论 SHP1能有效地诱导K562细胞凋亡与红系分化。     

c-Ets1对K562细胞BCR-ABL融合基因表达的影响

目的探讨转录因子c-Ets1对K562细胞BCR-ABL融合基因表达的影响。方法将c-Ets1基因转染K562细胞,RT-PCR检测转染后BCR-ABL融合基因mRNA的表达;Western blot检测转染后融合蛋白p210的表达;MTT法检测对细胞增殖的影响;生物信息学方法初步分析BCR-ABL启动子的功能。结果 RT-PCR检测表明,c-Ets1可以抑制BCR-ABL基因mRNA的表达;Western blot检测显示c-Ets1可以抑制p210蛋白的表达;转染c-Ets1后细胞的生长抑制率为(25.52±6.75)%;BCR-ABL启动子区存在c-Ets1的潜在作用靶点。结论 c-Ets1可以抑制K562细胞BCR-ABL基因及p210的表达,进而抑制细胞的增殖。     

Chk1基因沉默增强K562/A02细胞对阿霉素敏感性的实验研究

目的研究Chk1基因沉默对人红白血病耐药细胞株K562/A02(耐阿霉素)生长的影响,探讨Chk1在白血病细胞耐药中的作用。方法通过电穿孔转染法将特异性靶向Chk1的短发卡状RNA(shRNA)导入K562/A02细胞,应用RT-PCR、Weston-blot检测细胞内Chk1的表达,经阿霉素作用后,流式细胞术(FCM)检测其细胞周期分布及细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖。结果与对照组和空载体转染组相比,shRNA使细胞中Chk1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%。抑制Chk1的表达可解除阿霉素引起的G2/M期阻滞;使阿霉素诱导的细胞凋亡率由转染前的(5.67±0.78)%上升到(19.25±1.41)%;在阿霉素浓度为0.4 mg/L、4 mg/L时,细胞的增殖活性分别下降12%、20%。结论靶向Chk1 shRNA有效地抑制了Chk1的表达,阻断了细胞周期检测点信号传导通路,从而增强了K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,有可能为临床上克服白血病的化疗耐药提供新的作用靶点及治疗途径。     

丙戊酸钠对K562细胞的增殖抑制作用

目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)对慢性髓系白血病细胞株K562的增殖抑制作用.方法:噻唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度VPA对K562细胞增殖的抑制作用;Western Blot法检测K562细胞Bax和Bcl-2蛋白的表达.结果:VPA能显著抑制K562细胞的增殖(P＜0.01),VPA处理K562细胞72h的半数抑制浓度(IC50)为(2.34±0.14)mmol/L;3mmol/L VPA处理K562细胞72h后,Bax蛋白的表达明显升高、Bcl-2蛋白的表达明显降低.结论:VPA可通过上调Bax的表达、下调Bcl-2的表达抑制K562细胞增殖,诱导K562细胞凋亡.     

NK细胞与K562细胞之间相互免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的：探讨NK细胞与K562细胞混合培养前、后其杀伤活性的变化及分子机制。方法：流式细胞仪检测NK细胞与K562细胞混合培养前、后细胞表面相应分子的变化,LDH释放法测定效靶比20∶1时NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果：相互编辑前,K562细胞表面MICA/MICB的表达率为(79.90±0.87)%,NK细胞表面NKG2D、KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为(98.27±0.67)%、(45.70±1.22)%和(35.60± 1.35)%。相互编辑后,K562细胞表面MICA/MICB和NK细胞表面NKG2D的表达率分别为（35.56±1.01）和（34.67±3.88）%,均明显低于编辑前（Ｐ=0.000）;NK细胞表面KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为（47.20±1.08）%和（34.03±1.20）%,与编辑前比较差异均无显著性(Ｐ>0.05)。效靶比20∶1时,NK细胞对编辑后的K562细胞的杀伤活性为(24.07±0.58)%,编辑后的NK细胞对K562细胞的杀伤活性为(16.95±2.00)%,均明显低于编辑前NK细胞对K562细胞的杀伤活性［(54.03±3.46)%］(Ｐ＝0.000)。结论: NK细胞与K562细胞持续性接触后,双方发生了相互免疫编辑作用;NK细胞的杀伤活性下降,其分子机制是细胞表面相应的配受体发生了变化。     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.     

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞增殖和细胞周期的影响

摘 要：目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞增殖和细胞周期的影响，探讨HCV-NS4B在HCV致病中的可能机制。方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2及重组质粒PCXN2-NS4B转染入 LO2肝细胞，G 418筛选。RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内。MTT法绘制生长曲线，观察NS4B对肝细胞生长的影响；流式细胞仪检测细胞周期的情况；免疫组化方法观察PCNA、cyclinD1的表达情况。结果 NS4B转染入LO2有表达；绘制生长曲线示NS4B可促进肝细胞生长；细胞周期检测显示转染空载体PCXN2的细胞57.73％±19.73％进入G0/G1期、29.25％±6.95％进入S期、6.80％±4.67％进入G2/M期；转染PCXN2-NS4B的细胞46.89％±5.60％进入G0/G1期、36.31％±4.36％进入S期、16.80％±6.79％进入G2/M期；转染NS4B的细胞PCNA、cyclinD1表达率较转染空白载体组高，两组比较差异有显著性（P<0.01）。结论 HCV-NS4B可能通过调节某些基因转录与表达，促进DNA合成，干扰肝细胞周期，促进肝细胞增殖。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响

目的构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响。方法克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3．1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3．1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响。结果重组质粒pcDNA3．1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍。MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72h抑制率最高,达38．63％。结论成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3．1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应。为进-步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。