叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2b HAS2表达下调

目的：该研究利用叶酸拮抗剂甲氨喋呤（MTX）构建叶酸生物学活性受抑制的斑马鱼模型后，观察叶酸生物学活性受抑后对斑马鱼心脏发育的干扰作用以及对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响。 方法：用不同浓度的MTX处理不同发育时段的斑马鱼胚胎，于48 hpf（hours post fertilization）观察胚胎心脏发育情况并计数各组心脏发育异常个体的百分比及心率，评定MTX 对斑马鱼心脏发育的影响程度。用1.5×10-3 M的MTX处理6~10 hpf 发育时段的斑马鱼胚胎作为MTX处理组。于24 hpf及48 hpf 在显微镜下观察MTX处理组斑马鱼胚胎心脏发育情况。借助胚胎整体原位杂交和Real-time PCR 的方法检测BMP2b和HAS2在正常对照组及MTX处理组胚胎的表达水平。结果：胚胎早期发育阶段6~12hpf是斑马鱼胚胎对MTX的敏感时期。显微镜下观察结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育延迟，并有心脏形态发育明显异常。胚胎整体原位杂交结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2在心脏的表达于36 hpf及48 hpf下调。Real-time PCR 结果显示MTX处理组斑马鱼BMP2b的相对表达量在12，24，36及48 hpf减少，HAS2的相对表达量在24，36及48 hpf减少。结论：叶酸生物学活性受抑对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。［中国当代儿科杂志，2007，9（2）：159-163］     

叶酸缺乏对斑马鱼背主动脉发育的影响

目的 观察叶酸缺乏斑马鱼胚胎的背主动脉(DA)发育情况,初步探讨叶酸缺乏后胚胎DA发育异常的机理.方法 采用将二氢叶酸还原酶(DHFR)功能阻断的方法构建叶酸缺乏斑马鱼模型,分别应用DHFR抑制剂甲氨蝶呤(MTX)以及DHFR基因knock-down技术处理斑马鱼胚胎.在胚胎发育至48 hpf时在显微镜下观察胚胎的整体发育情况,在60 hpf时应用荧光显微造影的方法观察胚胎的背主动脉发育状况.利用胚胎整体原位杂交和real-time PcR的方法检测影响DA发育的关键因子ephrinB2、Ang-1和Radar的表达情况,利用TUNEL法检测胚胎底索的凋亡情况.结果 MTX处理组胚胎以及DHFR knock-down组胚胎有相似的胚胎发育异常表型.荧光显微造影显示叶酸缺乏组胚胎的DA发育异常.叶酸缺乏组胚胎的ephrinB2、Ang-1和Radar表达减弱,底索凋亡增加.结论 叶酸缺乏可导致斑马鱼胚胎背主动脉发育异常,其机理与ephrinB2、Ang-1和Radar的表达减弱以及底索凋亡增加有关.     

视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏房室分化

目的观察外源性视黄酸对斑马鱼心脏前后轴发育即心脏房室分化的影响。方法采用化学遗传学方法在斑马鱼胚胎发育至12.5hpf(hours post fertilization)给予5×10-8mol/L和10-7mol/L外源性视黄酸处理1.5h。应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸对心脏特异基因vmhc,amhc,nkx2.5和nppa表达的影响。结果vmhc,amhc探针的整体原位杂交结果显示视黄酸处理会导致斑马鱼胚胎心脏的前后轴发育异常,表现为vmhc表达细胞的范围缩小,amhc表达细胞的范围明显增大。视黄酸可以明显增强nppa在心脏的表达。视黄酸对心脏房室分化的影响在48hpf后表现得明显。结论5×10-8mol/L和10-7mol/L视黄酸在12.5hpf处理斑马鱼胚胎对斑马鱼心脏早期发生没有影响。斑马鱼发育过程中,视黄酸对心脏的房室分化过程起着重要的调控作用,视黄酸支持心房的分化和发育,同时抑制心室发育。     

二维电泳分析胎儿酒精综合征斑马鱼模型蛋白表达谱

目的 利用二维电泳分析乙醇诱导斑马鱼胚胎发育畸形的可能分子机制.方法 采用400 mmol/L乙醇在斑马鱼胚胎圆顶期处理3 h,观察乙醇导致的斑马鱼胚胎发育畸形;通过二维凝胶电泳分析受精卵期、圆顶期、胚盾期和5-体节期的胚胎总蛋白,采用差减分析法减少母源性蛋白的干扰,比较5一体节期正常对照组和乙醇处理组斑马鱼胚胎蛋白表达谱的改变;通过原位杂交验证二维电泳的分析结果.结果 400 mmol/L乙醇处理导致62%的胚胎产生体轴发育障碍和60%的胚胎产生独眼畸形.二维电泳分析结果显示,400 mmol/L乙醇处理会导致受精后12 h(12 hours post fertilization,12 hpf)斑马鱼胚胎胶原蛋白2a1和TAR DNA结合蛋白表达分别下调81%和73%.随后原位杂交显示,胶原蛋白2a1在乙醇处理组胚胎体轴的表达明显下调;24 hpf乙醇处理胚胎胶原蛋白2a1在胚胎体轴的表达水平逐渐恢复正常,但神经管结构受到严重影响.结论 乙醇处理后斑马鱼胚胎发育畸形可能是由于乙醇干扰了胚胎发育过程中胶原蛋白2a1和TAR DNA结合蛋白的表达;其中乙醇对胶原蛋白2a1在轴中胚层早期表达的干扰,可能是导致发育后期体轴和神经管畸形的重要原因.     

重组血管生成抑制因子r—K4K5的分离纯化与功能鉴定

目的 分离纯化r-K4K5,探讨r-K4K5对牛毛血管内皮（BCE）细胞、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成及实验性人肺腺癌SPC-A1生长的抑制作用。方法 通过盐析、凝胶过滤提纯r-K4K5,BCE细胞在含r-K4K5的DMEM中培养24、48、72h后分别计数;孵化7d的鸡胚加r-K4K5后继续孵育72h,观察新生血管生成;已经接种入SPC-A1肺腺癌组织的荷瘤裸小鼠（Balb/c,nu/nu）,瘤旁注射r-K4K5继续饲养,观察肿瘤生长变化。结果 r-K4K5抑制BCE细胞增殖,48～72h作用明显;r-K4K5处理的CAM组中直径小于50um的小血管明显减少;高剂量r-K4K5治疗的荷瘤裸小鼠组,平均瘤重与对照组比较有统计学意义。结论 r-K4K5能够抑制BCE细胞增殖,抑制鸡胚CAM新生血管生成,抑制实验性人SPC-A1肺腺瘤生长。     

raldh2基因阻抑导致斑马鱼心脏发育畸形的机制

目的通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(MO)阻抑视黄醛脱氢酶2(raldh2)基因表达,探讨raldh2基因阻抑对斑马鱼胚胎心脏发育的影响及可能的分子机制。方法根据斑马鱼raldh2基因起始密码区域序列设计合成吗啡啉修饰的反义寡核苷酸,采用显微注射方法阻抑斑马鱼胚胎raldh2基因表达。构建raldh2-EG-FP重组质粒进一步验证MO的特异性和有效性。分析raldh2基因阻抑后对胚胎发育,尤其心脏表型和功能的影响。通过胚胎整体原位杂交,分析心脏相关nppa和tbx20基因表达模式以及raldh2阻抑后对其表达的影响。结果显微注射raldh2-MO能有效地特异地阻抑斑马鱼胚胎raldh2基因表达,raldh2-MO对胚胎发育影响呈剂量依赖性。raldh2基因阻抑可导致胚胎心脏发育畸形,干扰正常的房室分化和向右环化,导致房室瓣血液反流。与野生型胚胎比较,raldh2基因阻抑组胚胎心率和心室收缩分数降低(P<0.05),心功能受损。整体原位杂交结果显示raldh2基因阻抑后nppa基因表达改变,心室部位nppa表达清晰,而心房部位表达减弱。tbx20基因在心脏、运动神经元、顶盖及视网膜表达,raldh2基因阻...     

斑马鱼发育遗传学研究进展

斑马鱼是研究发育和遗传的极有价值的模式生物。斑马鱼遗传筛选发现了许多控制脊椎动物发育的新基因，这些基因涉及器官形成的分子机制。本文就斑马鱼心血管系统及血液系统发育遗传学研究进展作一综述。     

人反义VEGF121真核表达质粒的构建及其对胰腺癌细胞VEGF表达的影响

血管内皮生长因子(VEGF)能特异性地刺激血管内皮细胞增殖，在肿瘤的血管生成中发挥着关键作用。胰腺癌作为实体瘤其发生、发展与肿瘤血管生成有着密切的联系。本研究采用分子生物学方法构建人反义VEGF121真核表达质粒，并转染人胰腺癌细胞系BxPC-3，为通过抑制VEGF引起的血管生成来抑制胰腺癌的增殖提供了实验基础。     

二维电泳分析胎儿酒精综合征斑马鱼模型蛋白表达谱

目的 利用二维电泳分析乙醇诱导斑马鱼胚胎发育畸形的可能分子机制.方法 采用400 mmol/L乙醇在斑马鱼胚胎圆顶期处理3 h,观察乙醇导致的斑马鱼胚胎发育畸形;通过二维凝胶电泳分析受精卵期、圆顶期、胚盾期和5-体节期的胚胎总蛋白,采用差减分析法减少母源性蛋白的干扰,比较5一体节期正常对照组和乙醇处理组斑马鱼胚胎蛋白表达谱的改变;通过原位杂交验证二维电泳的分析结果.结果 400 mmol/L乙醇处理导致62%的胚胎产生体轴发育障碍和60%的胚胎产生独眼畸形.二维电泳分析结果显示,400 mmol/L乙醇处理会导致受精后12 h(12 hours post fertilization,12 hpf)斑马鱼胚胎胶原蛋白2a1和TAR DNA结合蛋白表达分别下调81%和73%.随后原位杂交显示,胶原蛋白2a1在乙醇处理组胚胎体轴的表达明显下调;24 hpf乙醇处理胚胎胶原蛋白2a1在胚胎体轴的表达水平逐渐恢复正常,但神经管结构受到严重影响.结论 乙醇处理后斑马鱼胚胎发育畸形可能是由于乙醇干扰了胚胎发育过程中胶原蛋白2a1和TAR DNA结合蛋白的表达;其中乙醇对胶原蛋白2a1在轴中胚层早期表达的干扰,可能是导致发育后期体轴和神经管畸形的重要原因.     

斑马鱼视网膜感光细胞的发育及视蛋白的表达

目的研究斑马鱼视网膜感光细胞的发育和视蛋白的表达，明确利用斑马鱼研究视网膜和感光细胞的可行性。方法制备斑马鱼视网膜感光细胞视蛋白（视杆细胞视紫质、视锥细胞紫外线视蛋白和视锥细胞蓝色视蛋白）的RNA探针。收集受精后72，96，120h的斑马鱼眼球组织进行切片、电镜观察和整体原位杂交。结果斑马鱼的神经视网膜分层排列，包括3个细胞层和2个丛状层。随时间发展，视网膜的发育逐渐成熟，3个细胞层的细胞排列更加整齐，感光细胞的外节盘发育更加成熟，3种视蛋白的表达逐渐增强，范围扩大。结论利用斑马鱼进行视网膜和感光细胞的研究是可行的，视蛋白可作为感光细胞的标记。