TGF-β1对瘢痕成纤维细胞α-SMA表达的诱导作用

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对瘢痕成肌纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的诱导作用.方法以5例增生性瘢痕为标本,3例正常瘢痕为对照,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察了在不同TGF-β1浓度条件作用下,来源于增生性瘢痕和正常瘢痕的成纤维细胞表达α-SMA的情况.结果①不同浓度的TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ug/L的TGF-β1作用最有效;②与来源于正常瘢痕的成纤维细胞相比,来源于增生性瘢痕的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感.③对同一瘢痕来源的成纤维细胞而言,三维培养体系中α-SMA的含量要明显低于二维培养体系.结论①在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成肌纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;②增生性瘢痕中成纤维细胞与正常瘢痕中成纤维细胞性状存在着差异,对TGF-β1敏感性不同;③细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少.     

Fn14诱导人皮肤成纤维细胞分泌细胞外基质

目的研究成纤维细胞生长因子诱导分子-14(Fn14)对人皮肤成纤维细胞(HSF)分泌细胞外基质的影响,探讨皮肤纤维化新的干预环节。方法分离HSF,构建Fn14表达载体,将其转染HSF,用Western blot方法检测Fn14、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白表达水平;Real-time PCR(RT-qPCR)检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原(ColⅢ)m RNA表达水平。结果构建的Fn14表达载体可成功转染HSF细胞,并使HSF细胞α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平升高。结论 Fn14能促进HSF胶原的表达,提示其在促进皮肤纤维化的病理过程中起着重要的作用。     

反义及正义Vim重组逆转录病毒表达载体的构建

目的构建反义及正义波形蛋白重组逆转录病毒载体，研究波形蛋白在反应性胶质化中的功能与作用。方法应用分子克隆方法克隆、鉴定、包装并感染培养的星形胶质细胞。结果同时获得全长反义及正义Vim逆转录病毒克隆细胞株和较高滴度的病毒上清，反义Vim逆转录病毒抑制培养星形细胞的Vim表达。结论重组的反义及正义Vim逆转录病毒可用于进一步的实验研究。     

结缔组织生长因子体外促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用.方法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,分别给予不同剂量CTGF刺激(10 ng/ml),以及CTGF ASODN转染,48 h后用Western blot方法比较各组间α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达变化.结果刺激48 h后,对照组表达少量α-SMA蛋白;小剂量CTGF刺激组和大剂量CTGF 刺激组作用48 h后,α-SMA表达量均显著增多,且成浓度依赖性变化(P<0.01);而CTGF ASODN转染组α-SMA蛋白表达与对照组比较明显减少(P<0.05).结论 CTGF在体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞(myofibroblast ,MyoF)的转分化,阻断或者抑制其表达可能将更有效的治疗瘢痕挛缩.     

病理性瘢痕和正常皮肤来源成纤维细胞CD90、α-SMA表达的研究

目的检测体外培养的病理性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中CD90、α-SMA表达情况,并分析二者的相关性。方法取手术切除的瘢痕疙瘩4例、增生性瘢痕12例、正常皮肤（瘢痕边缘）16例,每组标本中选取特异性较强的组织块各3例,原代培养不同组织来源的成纤维细胞,取第3代细胞制成细胞爬片,免疫荧光双重标记（CD90和α-SMA）细胞,通过计算每系成纤维细胞CD90、α-SMA的荧光值,检测成纤维细胞中CD90、α-SMA的表达情况,并分析CD90和α-SMA表达的关系。结果增生性瘢痕来源成纤维细胞的CD90表达强于正常皮肤的成纤维细胞（P〈0.05）,瘢痕疙瘩来源成纤维细胞的CD90表达和正常皮肤的表达无差异（P〉0.05）;增生性瘢痕与其周围皮肤、瘢痕疙瘩与其周围正常皮肤来源成纤维细胞的α-SMA表达均无差异（P〉0.05）;在同一细胞内CD90和α-SMA具有共区域和共趋势表达的特点。结论增生性瘢痕来源的成纤维细胞存在CD90多量表达的特异表型,瘢痕成纤维细胞CD90和α-SMA有共区域表达的特点和一致的表达趋势,二者可能有一定的协同关系。     

TGF-β_1与α-SMA在小鼠肺纤维化模型中的表达及其相互关系

目的探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在小鼠肺纤维化模型中的表达,及其之间的相互关系。方法气管内灌注博莱霉素(7 mg/kg)制备肺纤维化模型,进行HE、Masson染色并采用免疫组织化学检测小鼠肺纤维化组织中TGF-β_1和α-SMA的表达。结果对照组中α-SMA表达于支气管和大血管周围的平滑肌细胞,模型组中α-SMA表达于支气管、大血管周围的平滑肌细胞及成纤维细胞灶,TGF-β_1表达于支气管、大血管周围的成纤维细胞、炎细胞以及成纤维细胞灶,与α-SMA表达相似。TGF-β_1和α-SMA均与小鼠肺纤维化程度均呈正相关(r=0.628、0.766,P0.01)。TGF-β_1与α-SMA呈正相关(rs=0.728,P0.01)。结论 TGF-β_1和α-SMA在肺间质纤维形成过程起到重要作用,并可能协同参与。     

α-平滑肌肌动蛋白和β-肌动蛋白在瘢痕组织中的表达

目的探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和β-肌动蛋白(β-actin)对增生性瘢痕形成的可能作用.方法采用荧光定量PCR法检测10例增生性瘢痕和10例正常皮肤组织中α-SMA和β-actin的表达水平.结果增生性瘢痕组织中α-SMA和β-actin表达水平均高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P＜0.01).结论α-SMA和β-actin在瘢痕增生中起重要作用;由于β-actin在瘢痕组织和正常皮肤中的不恒定性,建议在瘢痕的mRNA定量研究中不作为内参照物.     

α-平滑肌肌动蛋白和β-肌动蛋白在瘢痕组织中的表达

目的 探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和β-肌动蛋白(β-actin)对增生性瘢痕形成的可能作用。方法 采用荧光定量PCR法检测10例增生性瘢痕和10例正常皮肤组织中α-SMA和β-actin的表达水平。结果 增生性瘢痕组织中α-SMA和β-actin表达水平均高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 α-SMA和β-actin在瘢痕增生中起重要作用;由于β-actin在瘢痕组织和正常皮肤中的不恒定性,建议在瘢痕的mRNA定量研究中不作为内参照物。     

增生性瘢痕胶原结节中成纤维细胞生物学行为的研究

目的研究增生性瘢痕胶原结节中成纤维细胞(fibroblast, Fb)生物学行为及其意义。方法 收集瘢痕切除植皮手术中切除的瘢痕组织及剩余的正常皮肤标本,H-E染色观察正常皮肤与瘢痕组织胶原结节及非结节区域的组织形态学差异,免疫组织化学法检测正常皮肤与瘢痕组织中Ki67及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达及分布情况。结果 与正常皮肤及增生性瘢痕非胶原结节区域相比,增生性瘢痕胶原结节中可见大量Fb,Ki67及α-SMA阳性表达的Fb亦主要分布于胶原结节区域。结论 胶原结节处Fb增殖活跃,并大量分化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)。MFB的大量存在提示局部组织处于高张力水平,后者可能是导致Fb功能活跃、大量存在从而形成胶原结节的重要机制之一。     

内源性结缔组织生长因子介导转化生长因子β1对肾小管上皮细胞的转分化效应

目的：探讨内源性结缔组织生长因子（CTGF）在人肾小管上皮细胞（HK2）转分化过程中的作用。方法：将HK2细胞分为4组：对照组；转化生长因子β1（TGF-β1）5ng／ml刺激组；TGF-β1 5ng／ml刺激4-CTGF反义0DN 3 mmol／L干预组；TGF-β1 5ng／ml刺激＋CTGF正义ODN3mmol/L对照组。用倒置显微镜观察各组细胞的形态学变化，用RT-PCR检测各组细胞中CTGF、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）mRNA表达变化。结果：TGF-β1刺激使HK2细胞形态由椭圆形转为梭形；下调E-cadherinmRNA表达。上调CTGF、α-SMA和FNmRNA表达．且CTGFmRNA表达变化在时间上早于E-cadherin、α-SMA和FNmRNA表达变化；CTGF反义ODN可对抗TGF-β1引起的细胞形态学改变和E-cadherin、CTGF、α-SMA、FiNmRNA表达变化效应。结论：内源性CTGF介导了TGF-β1对HK2细胞的转分化效应。     

维拉帕米对瘢痕成纤维细胞β1、α1-4整合素表达的影响

目的：了解维拉帕米对瘢痕成纤维细胞表达β1、α1-4整合素的影响，并从整合素功能角度探讨其抗瘢痕增生挛缩作用机制。方法：瘢痕成纤维细胞体外培养，利用原位ELISA技术检测瘢痕成纤维细胞在维拉帕米作用下后表达整合素的水平。结果：不同浓度的维拉帕米对瘢痕成纤维细胞膜上的β1、α1-4整合素粘附分子表达均有着不同程度的抑制作用，其中对β1、α1、α2、α3和α4整合素的最大抑制作用浓度分别达21.01%、27.47%、11.44%、30.77%和29.60%；另外，瘢痕成纤维细胞在低浓度维拉帕米作用时对其细胞形态无明显影响，而当维拉帕米浓度超过50ug/ml时，可造成细胞体积缩小、间隙增大。结论：维拉帕米对瘢痕成纤维细胞β1、α2、α3和α4整合素表达有较为显著的抑制作用；通过抑制细胞整合素粘附分子表达不但对细胞的生物学活性有一定影响，而且对细胞与细胞外间质之间的收缩动力传导起阻滞作用。由此提示，维拉帕米具有良好的抗瘢痕增生挛缩作用。值得进一步研究探讨。     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的 构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体，探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性。方法 用DNA直接克隆连接的方法，构建反义Smad3腺病毒重组质粒，再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后，感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录。结果 经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功，RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达。结论 所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达，可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究。     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体,探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性.方法用DNA直接克隆连接的方法,构建反义Smad3腺病毒重组质粒,再用293细胞包装.重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞, RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录.结果经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达.结论所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达,可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究.     

白血病抑制因子对肾间质成纤维细胞活化的影响

目的 研究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)对肾间质成纤维细胞活化的干预作用.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞,分对照组、转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理组及TGF-β1和LIF共处理组,电镜下观察细胞形态变化,通过RT-PCR及Western blot检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达的改变,双抗体夹心ABC-ELISA检测细胞上清Ⅰ型胶原.结果 TGF-β1引起成纤维细胞激活,产生形态学改变,α-SMA表达增高(P<0.01),Ⅰ型胶原产生增加(P<0.01).与TGF-β1处理组相比,LIF干预组形态学改变不明显,LIF能干预TGF-β1引起大鼠肾间质成纤维细胞α-SMA表达和Ⅰ型胶原产生.结论 LIF可以抑制TGF-β1引起的肾间质成纤维细胞激活.     

黏着斑激酶在增生性瘢痕中的作用研究

目的探讨黏着斑激酶(FAK)在整合素与TGF-β受体介导的瘢痕增生和挛缩过程中的作用.方法取10例增生性瘢痕标本进行成纤维细胞原代培养,通过荧光定量PCR法(FQ-PCR),测定经FAK抗体阻断后培养的瘢痕成纤维细胞中整合素β1、TGF-β受体Ⅰ(TGF-βRⅠ)以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达量的变化.结果经FAK抗体阻断后培养的成纤维细胞整合素β1、TGF-βR Ⅰ以及α-SMA的基因拷贝数均较阴性对照组明显下降(P<0.05).结论FAK可能是整合素和TGF-βR两条信号传导途径的交汇点,调节整合素、TGF-βR、α-SMA的基因表达和蛋白合成,在瘢痕增生和挛缩过程中具有重要作用.     

肝细胞生长因子对转化生长因子诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化的影响

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对转化生长因子β1(TGFβ-1)诱导肺泡上皮细胞转分化的影响。方法:应用TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化。将人肺腺癌A549细胞株培养液分为4组:①对照组;②HGF组;③TGFβ-1组;④HGF+TGFβ-1组,应用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肺泡上皮细胞特异性标志物肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的表达。结果:①TGF-β1组肺泡上皮细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态。②TGF-β1组的细胞α-SMA的表达明显增加,SP-A的表达明显减低。③HGF组的细胞形态学、α-SMA、SP-A的表达与对照组无明显差异。④HGF+TGFβ-1组,多数细胞保持原来肺泡上皮细胞的形态,α-SMA表达明显低于TGFβ-1组、SP-A表达明显高于TGFβ-1组。结论:HGF能够在一定程度上负性调控TGFβ-1诱导的肺泡上皮细胞的转分化。     

肝细胞生长因子对IL-1α刺激肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化的作用

目的研究肝细胞生长因子(HGF)对IL-1α诱导的肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化(TEMT)及细胞分泌功能的影响。方法在体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)中加入IL-1α 20ng／ml诱导．并加入大(1600ng／ml)、中(1200ng／ml)、小(800ng／ml)剂量HGF阻断，流式细胞仪和免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达；倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态变化；ELISA法测定培养细胞上清液分泌的粘连蛋白(FN)含量。结果IL-1α刺激后细胞转变为类似成纤维细胞形态；α-SMA阳性细胞百分数及α-SMA表达的平均荧光强度明显增加(P＜0．05)；培养上清液中FN含量增加(P＜0．05)。HGF可剂量依赖性地抑制IL-1α诱导NRK52E细胞形态学改变及α-SMA的表达(P＜0．05)，不同程度地抑制IL-1α的促FN分泌作用(P＜0．05)。单独加入不同剂量HGF对肾小管细胞无影响。结论HGF可抑制IL-1α诱导的TEMT作用，减少FN的分泌，对肾间质纤维化具有负性调节作用。     

正、反义VEGF基因转染对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖行为的影响

目的探讨正、反义血管内皮生长因子(VEGF)基因对人增生性瘢痕成纤维细胞(HHSFb)增殖行为的影响。方法采用组织块法获取HHSFb,行细胞免疫化学鉴定。构建靶向VEGF基因pcDNA3.1(+)/hVEGF165(正义组)、pcDNA3.1(-)/hVEGF165(反义组)和空质粒pcDNA3.1(+)(空载体组)转染人成纤维细胞,以及未行转染处理的人成纤维细胞(对照组),共设为4组。经G418筛选获得阳性转染细胞克隆。逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)显示VEGF基因在细胞内的表达,上清行酶联免疫吸附反应(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平,MTT测定细胞体外生长情况。结果成功构建正、反义VEGF基因表达载体。经统计学分析,与对照组和空载体相比,正义组VEGF mRNA表达增强,蛋白表达增强;反义组VEGF mRNA表达明显减弱,蛋白表达明显降低。MTT结果显示,转染前后细胞体外生长速度基本一致。结论正义VEGF基因重组质粒对HHSFb内源性VEGF的表达有促进作用,反义VEGF基因重组质粒可有效抑制HHSFb内源性VEGF的表达。     

Ac\|SDKP调节Rac1信号抑制皮肤肌成纤维细胞的转化和迁移

目的 研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)通过阻断小G蛋白Ras相关的C3肉毒素底物(Rac1)信号,抑制转化生长因子β1(TGF-β1)介导的皮肤肌成纤维细胞转化的机制。 方法 原代培养大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞,分为空白对照组、TGF-β1诱导组及Ac-SDKP预处理组。划痕实验检测细胞迁移能力,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Rac1蛋白的表达,Western-blot法检测α-SMA、血清应答因子(SRF)、心肌蛋白相关转录因子(MRTF-A)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Rac1蛋白的表达。 结果 细胞划痕实验显示,TGF-β1诱导组与空白对照组比较,细胞迁移至中央划痕区的距离明显增大,Ac-SDKP预处理组与TGF-β1诱导组比较,细胞迁移至中央划痕区的距离减小。免疫细胞化学法检测结果显示,TGF-β1诱导组α-SMA和Rac1的阳性表达较空白对照组增强,而Ac-SDKP预处理组可明显抑制α-SMA和Rac1的阳性表达。TGF-β1诱导组的α-SMA,SRF,MRTF-A,ColⅠ及Rac1蛋白表达均较空白对照组明显上调,Ac-SDKP预处理组的蛋白表达较TGF-β1诱导组下降(P<0.05)。 结论 Ac-SDKP能够阻断Rac1信号,抑制TGF-β1介导的皮肤成纤维细胞迁移能力的提高和肌成纤维细胞转化。     

Meprinα对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原合成的调节作用

目的观察Meprinα对转化生长因子(TGF)-β1介导的成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的调节作用。方法原代培养肺成纤维细胞,采用TGF-β1诱导,并予以重组Meprinα及放线酰胺素(Actinonin)预处理。免疫细胞化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,免疫印迹法检测Meprinα、I型胶原、α-SMA的表达。结果 TGF-β1能够促进肺成纤维增殖和迁移能力,显著上调I型胶原、α-SMA的表达,同时降低Meprinα的表达(P<0.05)。免疫印迹结果显示,予以Meprinα预处理能够显著抑制TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05);予以Actinonin预处理,则能够显著促进TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05)。结论 Meprinα具有抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的作用。