心肌细胞蛋白质合成与活力的关系

目的 观察不同药物干预下,新生大鼠心肌细胞蛋白含量与活力的关系.方法 采用考马斯亮蓝法检测蛋白含量,MTT比色法测量心肌细胞的A490值,以A490/总细胞数之比作为衡量心肌细胞活力的指标.结果 心肌细胞蛋白含量随着ET-1的浓度增大而增加,ET-1引起蛋白含量的增加可被拉西地平和川芎嗪减弱,心肌细胞的A490/总细胞数之比随着ET-1的浓度增加而降低,拉西地平和川芎嗪也可进一步降低心肌细胞的A490/总细胞数之比.结论 心肌细胞蛋白质含量的增加并不引起细胞活力的增强,表明心肌细胞蛋白含量与活力之间可能缺乏相关关系.     

乌骨藤提取物对原代新生大鼠心肌细胞的毒性研究

目的探讨乌骨藤提取物（MTE）对原代新生大鼠新生心肌细胞的毒性影响。方法分离和培养SD大鼠心肌细胞,将MTE组分A溶于二甲基亚砜,分别使用20、40、80、160和320滋g/ml的MTE和8000滋g/ml的5-氟尿嘧啶作为阳性对照处理原代大鼠心肌细胞24h,采用MTS法测定不同浓度MTE对体外培养原代大鼠心肌细胞增殖的影响;采用RTCACardio系统建立体外心脏毒性筛选模型,对大鼠心肌细胞增殖、搏动进行检测。结果原代心肌细胞加入不同浓度的MTE后,细胞存活受到显著抑制,半数存活浓度（EC50）为207.3滋g/ml,随着MTE浓度的升高组分A抑制率增强（均P＜0.05）。原代心肌细胞接种到RTCACardioE-Plate96孔板上,24h后出现心肌细胞搏动。MTE处理后,细胞指数（CI）值显著下降,240滋g/mlMTE组分A处理后心肌细胞搏动迅速受到抑制,搏动频率由126次/min下降至0次/min,且不可恢复;160滋g/ml和80滋g/ml处理后分别在12h和6h后抑制作用减弱,搏动频率为40次/min和84次/min;40滋g/ml基本无影响。结论MTE组分A对原代新生大鼠心肌细胞具有细胞毒作用,能够显著影响其搏动功能。     

叠氮钠对心肌细胞活力影响的研究

目的：观察叠氮钠对原代培养大鼠心肌细胞活力的影响。方法：研究不同浓度叠氮钠在不同时间内对原代培养的大鼠心肌细胞活力的影响。结果：叠氮钠对心肌细胞活力的抑制作用随浓度增加以及作用时间延长明显增加。1mmol／L叠氮钠孵育细胞3h，细胞发生可逆的早期凋亡，大于6h，细胞发生不可逆的死亡。结论：低剂量叠氮钠可诱导原代培养的大鼠心肌细胞发生可逆的早期凋亡。     

大鼠心肌细胞诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究人间充质干细胞(MSCs)向心肌方向分化的机制.方法:将人MSCs以10000/cm2的密度接种,共分为四组:1)对照组;2)共同培养组:人MSCs和新生SD大鼠心肌细胞进行共同培养;3)条件培养液组:将从新生SD大鼠心肌细胞培养中获得的培养液,用于人MSCs的培养;4)细胞匀浆液组:将心肌细胞匀浆液用于人MSCs的培养.分别于实验第2、5、7天收集各实验组的人MSCs,进行Desmin及肌钙蛋白Ⅰ的免疫组化染色.在共同培养组中,同时还用抗人DNA进行的荧光原位杂交,以区分鼠来源的细胞及人来源的细胞.结果:在对照组、条件培养液组及细胞匀浆液组均未检测到心肌特异性蛋白的表达.在共培养组中,第2天,部分人MSCs开始表达Desmin,第5天细胞开始表达cTnI,至第7天阳性表达率达35%左右.结论:与大鼠心肌细胞共同培养可以诱导人MSCs向心肌方向的分化,而心肌细胞的条件培养液及心肌细胞匀浆不能诱导它们的心肌分化.     

抵抗素通过酪氨酸蛋白激酶2/信号转导子和转录激活子3信号通路诱导心肌细胞肥厚的分子机制研究

目的探讨酪氨酸蛋白激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路在抵抗素诱导H9C2心肌细胞肥厚中的作用及其可能分子机制。方法取生长同步化的H9C2心肌细胞随机分为对照组、抵抗素组、抵抗素+Ag490组和Ag490组。对照组细胞用低血清培养基培养;抵抗素组细胞用含浓度为50μg·L~(-1)抵抗素的低血清培养基培养;抵抗素+Ag490组细胞先用含100μmol Ag490低血清培养基培养,然后用含抵抗素浓度50μg·L~(-1)的低血清培养基继续培养;Ag490组细胞先用含100μmol Ag490低血清培养基培养,然后低血清培养;各组细胞均培养48 h(第1部分实验)或3 h(第2部分实验)。应用Image J软件测心肌细胞面积像素;二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白含量;采用Western blot检测各组心肌细胞磷酸化酪氨酸激酶(P-JAK2)、磷酸化信号转导子和转录激活子3(P-STAT3)、α肌动蛋白(α-SMA)和C-MYC蛋白相对表达量。结果抵抗素组心肌细胞表面积像素和单细胞蛋白含量均大于对照组、抵抗素+Ag490组和Ag490组(P<0.05);抵抗素+Ag490组心肌细胞表面积像素和单细胞蛋白含量大于对照组和Ag490组(P<0.05);对照组和Ag490组心肌细胞表面积像素及单细胞蛋白含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。抵抗素组心肌细胞α-SMA蛋白表达量较对照组、抵抗素+Ag490组、Ag490组均显著增加(P<0.05);其余各组心肌细胞α-SMA蛋白表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。抵抗素组心肌细胞C-MYC蛋白表达量较对照组、抵抗素+Ag490组、Ag490组均显著增加(P<0.05);抵抗素+Ag490组心肌细胞C-MYC蛋白表达量较对照组增加(P<0.05);其余各组心肌细胞C-MYC蛋白表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。抵抗素组心肌细胞PJAK2、P-STAT3蛋白表达量较对照组、抵抗素+Ag490组、Ag490组显著增加(P<0.05);其余各组心肌细胞P-JAK2、P-STAT3蛋白表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论抵抗素可诱导H9C2心肌细胞肥厚;JAK2/STAT3信号通路的激活在抵抗素诱导大鼠心肌肥大过程中发挥作用。     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

LO2细胞不同缺氧复氧时间细胞存活率检测及瘦素的影响

【目的】复制肝细胞缺血缺氧模型和瘦素对它的影响。【方法】将LO2细胞分别缺氧2h、4h、8h和12h和正常组,后用CCK-8检测各组细胞的A490值,与正常组比较算出细胞的存活率。并用不同浓度的瘦素(分别为100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L和1600μg/L)加入缺氧12h的LO2细胞,观察瘦素对其细胞存活率的影响。【结果】LO2细胞经厌氧培养后,缺氧2h、4h、8h和12h细胞CCK-8A490值显著低于缺氧正常组平均值(P<0.01),随着缺氧时间的延长,A490值、细胞存活率逐渐下降;经厌氧培养后的LO2细胞与正常组相比,细胞CCK-8A490值显著低于对照组(P<0.01),不同浓度的LEP能减轻厌氧培养的LO2细胞损伤,A490值、细胞存活增高。【结论】采用厌氧气体培养LO2细胞复制肝脏缺血模型是可行的;瘦素对经厌氧培养后的LO2细胞有保护作用。     

新生SD大鼠心肌细胞的原代分离和培养

目的:建立简便有效的心肌细胞分离和原代培养方法,获得具有理想数量和活性的原代心肌细胞。方法:无菌条件下取出生72h内的新生SD大鼠心脏,去除心肌结缔组织和心房组织,只保留左心室,采用胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化、差速贴壁分离的方法,获得心肌细胞进行体外培养,观察细胞的形态变化,对细胞的搏动频率、搏动细胞数进行统计分析。结果:分离的原代心肌细胞生长良好,核仁清晰可见。高倍镜下观察,心肌细胞接种12h后,少数细胞贴壁生长,且贴壁的少数单个细胞出现自发搏动,之后搏动细胞数以及细胞搏动频率都逐渐增加,接种48h后细胞完全铺展开来并连接成片,自发搏动呈现同步性和岛屿状。结论:本实验方法获得的新生SD大鼠心肌细胞生长状态好,细胞存活率和自发搏动性高,操作简单,重复性好,是一种理想、可靠的原代心肌细胞培养方法。     

VE对去卵巢大鼠血清T-SOD、GSH-PX活力与心肌细胞凋亡的影响

目的以去卵巢大鼠为更年期动物模型,观察心肌细胞抗氧化能力与凋亡的变化,探讨维生素E(VE)对老年心肌细胞凋亡的影响机制。方法以正常成年大鼠(假手术组)和去卵巢大鼠(老年对照组)为对照,实验组大鼠腹腔注射VE:5 mg/kg(小剂量组)、15 mg/kg(大剂量组),连续注射9周。采用比色法测血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)与心肌组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力,Hoechst染色法检测细胞凋亡。结果实验组大鼠血清T-SOD与心肌GSH-PX活力高于去卵巢大鼠,低于假手术组;大剂量组T-SOD与GSH-PX活力高于小剂量组;Hoechst荧光染色显示,VE大剂量组大鼠心肌细胞凋亡明显少于小剂量组,但多于假手术组,小剂量组心肌细胞凋亡与去卵巢组相似。结论大剂量VE可提高心肌抗氧化能力,减少心肌细胞的凋亡,延缓围绝经期妇女心肌细胞的衰老。     

华佗健聪汤对β淀粉样蛋白损伤的神经元存活率和细胞形态的影响

目的 研究华佗健聪汤对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤的神经元的存活率和细胞形态的影响.方法 取原代培养的神经细胞,随机分为正常组、中药组、模型组、阳性对照组.正常组神经细胞以无血清Neuralbasal培养基培养,不予以任何干预措施;模型组以浓度为10 μmol/L的Aβ对神经细胞予以干预;中药组:将含华佗健聪汤血清加入无血清Neuralbasal培养基中培养神经细胞24 h后,弃培养基,加入Neuralbasal培养基及10 μmol/L Aβ继续培养;阳性对照组:将中药组的含药血清换成未灌中药的正常大鼠血清及给予终浓度为20 μmol/L.人参皂苷Rg1,余均与中药组相同.培养24 h后,观察并拍摄细胞形态,MTT实验评价细胞活力.结果 华佗健聪汤组与模型组相比,细胞形态结构基本完好,OD值增高(P<0.05).中药组细胞成活率为82.64%,显著高于模型组细胞成活率(64.76%)(P<0.05).结论 华佗健聪汤对Aβ所致的大鼠神经元损伤有较好的保护作用.     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.