Transfection of HBV X gene into human liver cell line L02 and its effect on CⅡTAand HLA-DR expression

目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.     

电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响

目的通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索最佳的细胞转染方法和条件。方法以K562、Hep G2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒p CDNA3.1、p CDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达。结果当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,Hep G2细胞可以得到较高的转染效率。在K562细胞和Hep G2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P<0.05)。电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和Hep G2细胞的存活率显著低于脂质体法(P<0.05)。Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P<0.05)。结论最佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳。     

宫颈癌SiHa细胞脂质体与电穿孔转染效果比较

目的探讨脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene，FHIT）转染宫颈癌SiHa细胞过程中脂质体与电穿孔两种转染方法的效果有无区别。方法分别用脂质体和电穿孔方法将真核表达质粒PRcCMV—FHIT及PRcCMV转染SiHa细胞，用带绿色荧光蛋白的PEGFP—C2空质粒检测瞬时转染效率。结果脂质体与电穿孔两种方法的瞬时转染效率无明显差别，但转染过程中两种方法转染的细胞形态有差别；在筛选稳定转染细胞株的过程中，电穿孔法转染的细胞更易存活。结论两种方法均适于瞬时转染，而电穿孔法可能更适于稳定转染。     

HBV前C／C基因EB病毒载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 研究HBV前C/C区基因变异的生物学意义。方法 构建HBV前C/C区基因EB病毒表达载体,采用脂质体介导方法将重组质粒转染到HepG2细胞,并表达HBeAg。结果 重组质粒经PCR和酶切鉴定均阳性,转染的细胞目的DNA和表达蛋白检测均阳性。结论 采用EB病毒载体构建HBV前C/C基因的表达载体。能在HepG2细胞中稳定表达目的蛋白,由于EB病毒载体以附着体的形式复制,不整合于缩主染色体基因中,拷贝数稳定,适合于体外研究HBVC/C基因变异的生物学意义。     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

磷酸钙法与脂质体法转染HBV全基因组的比较

目的比较磷酸钙法和脂质体法转染全长HBV基因组的效率及对HBsAg和HBeAg表达的影响。采用真核细胞报告基因SEAP与HBVDNA共转染人肝癌细胞系HepG2。方法分别将带有分泌性碱性磷酸酶（SEAP）报告基因的质粒、表达绿色荧光蛋白的PCI—EFGP质粒与HBVDNA共转染HepG2细胞。培养后48h计数表达绿色荧光蛋白的细胞，收取细胞培养上清，用ELISA法测定SEAP活性，IMX法检测HBV表面抗原和e抗原水平。结果脂质体法转染HBV全基因组的效率明显高于磷酸钙转染法，转染后48h的细胞上清表面抗原和e抗原的表达也明显高于后者。结论脂质体转染法转染HBV的效率较磷酸钙转染法高，抗原表达水平高，是体外研究HBV的较理想方法。     

脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较

目的：对比脂质体与电穿孔法对 HepG2、SGC7901/ADM 两种细胞的转染效率。方法以 HepG2、SGC7901/ADM细胞为研究对象,采用脂质体法和电穿孔法分别转染pcDNA3．1‐EGFP质粒,流式细胞仪计算细胞存活率,借助绿色荧光标志蛋白eGFP测算转染效率。结果利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为（20．8±2．1）％,而电穿孔法转染效率增高至（49．6±2．5）％,二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901/ADM细胞所获得的阳性转染率为（25．4±1．3）％,而电穿孔法转染效率增高至（52．6±2．1）％,二者比较差异亦有统计学意义（P＜0．05）。结论使用电穿孔法能明显提高大片段载体的转染效率。     

HBV前C/C基因与绿色荧光蛋白基因融合表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的 :构建含HBV前C C基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体 ,并在真核细胞中表达。方法 :用PCR法扩增含 1.3倍HBVayw型全基因组真核表达载体pHBV1.3的前C C基因片断 ,应用含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒构建融合表达载体 ,采用脂质体介导方法将其转染到HEK2 93细胞 ,并用荧光显微镜及ELISA法检测融合蛋白的表达。结果 :经PCR及酶切鉴定 ,证实成功构建了含HBV前C C基因的真核表达重组体pEGFP -HB VC ,显微镜下观察及ELISA法证实在HEK2 93细胞中表达了相应融合蛋白。结论 :构建的重组表达载体能在真核细胞中表达目的蛋白与GFP的双功能融合蛋白 ,适合于针对HBV前C C区的相关研究。     

HBV C区基因真核表达载体的构建及转染

目的构建含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)增强子Ⅱ(enhancerⅡ,EnhⅡ)、核心启动子区(basal core promoter,BCP)和C区基因的真核表达载体,以研究EnhⅡ、BCP和C区基因的生物功能。方法提取HBV DNA,PCR法扩增EnhⅡ-BCP-C区基因片段;HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCR产物,胶回收纯化的DNA片段,连接入载体pBudCE4.1,酶切及DNA测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体DNA转染HepG2细胞和HeLa细胞,酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的HepG2细胞、HeLa细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的表达水平。结果双酶切及DNA测序鉴定,含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HepG2细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后裂解物中HBeAg表达水平均明显高于pBudCE4.1空载体转染HepG2细胞(均P<0.05),EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HeLa细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后的裂解物中HBeAg表达水平与pBudCE4.1空载体转染HeLa细胞比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论成功构建HBV EnhⅡ-BCP启动-C基因肝细胞特异表达的真核载体,有利于进一步研究EnhⅡ、BCP和C区基因某些突变位点的生物学意义。     

U937单核细胞几种不同转染方法的比较

 目的 采用不同质粒转染方法介导重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒转染U937单核细胞,以获得较高转染效率的方法。方法 分别采用电穿孔法、Effectene转染试剂、Lipofectamine 2000转染试剂、电穿孔+Effectene转染试剂、电穿孔+Lipofectamine 2000转染试剂及HilyMax转染试剂等不同方法介导质粒进行转染,测定不同方法的转染效率、目的基因mRNA表达水平及其对细胞活力的影响。结果 电穿孔+Effectene转染试剂组、电穿孔+Lipofectamine 2000组及HilyMax组的转染效率和目的基因mRNA表达较高,且HilyMax组对细胞活力影响较小。结论 将重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒体外成功转染入U937单核细胞中,通过优化转染方法提高转染效率、降低对细胞活力的影响,为基因治疗提供了实验基础。     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

罗格列酮经PPARγ受体介导HL-60细胞成熟分化

目的：研究人过氧化物酶体增殖物激活受体1（PPARγ）在白血病HL-60细胞分化中的作用．方法：采用Li—pofectamine2000脂质体进行HL-60细胞质粒转染．实验分单纯HL-60细胞培养组,空载体pIRES2-EGFP转染组,10μmol／L罗格列酮干预组和10μmol／L罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组．荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达．流式细胞仪检测转染效率,并对转染细胞成熟粒．单细胞特异性标志CD11b和CD14的表达进行分析．结果：转染的HL-60细胞可见绿色荧光表达,phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染效率为55％．流式细胞仪检测结果表明,罗格列酮干预组和罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染组的CD11b＋和CD14＋细胞检出率均显著高于未转染细胞组与空载体转染组（P〈0．05）,且罗格列酮联用phPPARγ-IRES2-EGFP质粒转染具有协同效应;而未转染细胞组与空载体转染组2种表型细胞百分率差异均无统计学意义（P〉0．05）．结论：罗格列酮可通过激活PPARγ促进HL-60细胞向粒-单细胞成熟分化,有望成为治疗白血病的候选药物．     

HBx基因缺失突变对HBV复制和转录的影响

目的构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,研究HBx缺失对HBV复制和转录的影响。方法以包含HBV全长基因组的野生型质粒pUC-HBV1.0为模板,用定点突变技术构建HBx基因缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7,并酶切和DNA测序鉴定。用SapⅠ单酶切这两种质粒,获得线性的野生型和HBx缺失突变型HBV基因组,经转染试剂PolyJetTMReagent介导分别瞬时转染到HepG2细胞中。在转染后各时间点Western blot检测HBx蛋白的表达,Southern blot和Real-time PCR同时检测细胞质DNA复制和细胞核cccDNA的合成,Real-time PCR分析定量HBV前基因组RNA(pgRNA)的转录。结果在野生组中可检测到HBx蛋白的表达,而在HBx突变组中HBx蛋白的表达低于Western blot的检测范围。两组中各时间点合成的cccDNA水平无统计学差异(P>0.05)。而在转染后96 hHBx突变组中细胞质DNA的复制和pgRNA的转录都分别比野生组减少50%～70%(P<0.05)。结论 HBx缺失虽然不影响细胞核HBV cccDNA的合成,但是它能下调细胞质HBV DNA的复制和pgRNA的转录。     

乙肝病毒X蛋白通过激活NF-κB信号通路上调肺耐药相关蛋白的表达

目的研究核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路是否是乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus Xprotein,HBx)上调多药耐药基因肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)的途径之一。方法建立稳定转染HBx基因的L02(L02/HBx)细胞系,用NF-κB信号通路阻断剂吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrollidine dithiocarbamate,PDTC)阻断NF-κB信号通路。采用荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及PDTC加入前后NF-κB信号通路的激活失活情况,同时用Real-time PCR和Western blot检测转染前后及PDTC加入前后LRP的表达情况。结果转染HBx基因后NF-κB信号通路被激活,LRP的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的(2.32±0.31)倍和(4.62±0.72)倍(均P<0.05);PDTC加入后NF-κB信号通路被阻断,LRP的mRNA和蛋白表达水平下调,分别为对照组的(1.75±0.19)倍和(2.39±0.54)倍(均P<0.05)。结论 NF-κB信号通路可能是HBx介导肝癌多药耐药,上调多药耐药基因LRP的途径之一。     

HBx基因及其缺失突变体(HBx-d382)对L02细胞microRNA表达谱的影响

目的 研究转染HBx基因(hepatitis B virus X gene)及其缺失突变体(HBX-d382)后L02细胞MicroRNA表达谱的变化.方法 通过脂质体转染和G418筛选获得L02/HBx、L02/HBx-d382阳性克隆,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和western blot鉴定目的 基因表达,利用MicroRNA芯片技术检测其对L02细胞MicroRNA表达的影响.结果 RT-PCR及Western blot表明在L02/HBx和L02/HBx-d382细胞株中存在目的 基因表达.MicroRNA芯片发现与L02细胞相比,L02/HBx-d382细胞有7个MicroRNA表达上调,5个MicroRNA表达下调,L02/HBx细胞有4个MicroRNA表达上调,12个MicroRNA表达下调.结论 成功构建HBx基因及其缺失突变体(HBx-d382)的真核表达模型,该类病毒基因会影响L02肝细胞的MicroRNA表达谱.     

ASPP2抑制HBx引起细胞自噬的实验研究

目的 观察ASPP2对HBx引起的细胞自噬的改变.方法 运用Hbx转染HepG 2细胞,ASPP2过表达与对照情况下,采用免疫印迹技术检测内源性自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和P62的表达,采用免疫荧光方法检测LC3荧光颗粒表达水平,采用RT-PCR技术检测自噬相关基因Beclin-1的mRNA转录水平.结果 免疫印迹技术显示转染HBx质粒比转染空载组的LC3Ⅱ量增多,但是在加入ASPP2腺病毒组比空载组的LC3Ⅱ表达量减少.免疫荧光显示转染HBx质粒比转染空载组的LC3荧光颗粒多,但是在共转染ASPP2质粒组比空载组的LC3荧光颗粒减少.RT-PCR方法显示转染HBX质粒比转染空载组的表达增多,但是在加入ASPP2腺病毒组比空载组表达量减少.结论 ASPP2可以抑制HBx引起的细胞自噬.