ASPP2抑制HBx引起细胞自噬的实验研究

目的 观察ASPP2对HBx引起的细胞自噬的改变.方法 运用Hbx转染HepG 2细胞,ASPP2过表达与对照情况下,采用免疫印迹技术检测内源性自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和P62的表达,采用免疫荧光方法检测LC3荧光颗粒表达水平,采用RT-PCR技术检测自噬相关基因Beclin-1的mRNA转录水平.结果 免疫印迹技术显示转染HBx质粒比转染空载组的LC3Ⅱ量增多,但是在加入ASPP2腺病毒组比空载组的LC3Ⅱ表达量减少.免疫荧光显示转染HBx质粒比转染空载组的LC3荧光颗粒多,但是在共转染ASPP2质粒组比空载组的LC3荧光颗粒减少.RT-PCR方法显示转染HBX质粒比转染空载组的表达增多,但是在加入ASPP2腺病毒组比空载组表达量减少.结论 ASPP2可以抑制HBx引起的细胞自噬.     

成像流式细胞仪检测细胞自噬水平研究

目的采用新型成像流式细胞仪量化检测细胞自噬水平,完善自噬检测手段。方法用绿色荧光蛋白(GFP)-微管相关蛋白轻链3(LC3)表达质粒转染Huh7细胞和H1299细胞,并进行24h饥饿处理,诱导自噬发生,分别用荧光显微镜拍照、蛋白免疫印迹法和成像流式细胞术3种方法检测细胞自噬水平。用IDEAS软件对成像流式细胞术的细胞自噬结果进行量化分析。结果荧光显微镜显示,Huh7细胞比H1299细胞中的自噬斑点少;蛋白免疫印迹法显示,与H1299细胞比较,Huh7细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比例较低,但2种方法均不能获得通量统计数据。成像流式细胞仪结果显示细胞自噬图像,2种细胞的GFP-LC3质粒转染效率基本一致(25.2%和27.6%);比较两者发生高水平自噬(LC3斑点数目为6个以上)的细胞比例,Huh7细胞仅为9.0%,显著少于H1299细胞(26.2%)。结论采用新型成像流式细胞仪检测细胞自噬,兼具量化分析和成像的优点,能弥补荧光显微镜和蛋白免疫印迹法的不足,是一种更优秀的自噬检测方法。     

HBV pgRNA在HBV相关疾病中的表达及其临床意义

目的 探讨血清HBV 前基因组RNA(pgRNA)在HBV相关疾病中的表达及其临床意义。方法 收集90例慢性乙型肝炎、54例乙肝肝硬化和44例HBsAg阳性原发性肝癌患者血清样本,进行HBsAg、HBeAg、HBV DNA和HBV pgRNA检测。结果 血清HBV pgRNA水平在慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组患者中的中位数分别为7.08、5.16 和4.08 log copies/mL ,差异有统计学意义(χ^2=24.743, P <0.001)。在HBeAg阳性患者中,HBV pgRNA水平在慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组患者中逐渐降低,差异有统计学意义(χ^2=14.864, P <0.001);且血清HBV pgRNA水平与血清HBV DNA、HBsAg水平及HBeAg滴度呈正相关。而在HBeAg阴性患者中,血清HBV pgRNA水平与血清HBV DNA、HBsAg水平及HBeAg滴度无相关性。结论 血清HBV pgRNA水平在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中逐渐降低,且与HBV DNA、HBsAg水平及HBeAg滴度呈正相关。     

HBV rtA181T突变对Huh7细胞自噬的影响

目的探讨HBV逆转录酶区A181T(rtA181T)位点突变对Huh7细胞自噬的影响。方法 Huh7细胞分别转染1.3mer HBV野生型质粒(WT组)、1.3mer HBV rtA181T突变型质粒(181T组)及1∶1共转WT和rtA181T突变型质粒(WT+181T组)。Western Blot、免疫荧光检测细胞内HBV表面蛋白(HBs)表达水平,ELISA检测细胞外HBs Ag表达水平;Western Blot分析内源性自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及P62表达水平,Real-time PCR检测自噬相关基因Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA的转录水平;同时转染绿色荧光蛋白LC3后,免疫荧光检测自噬颗粒。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果免疫荧光观察181T组、WT组及WT+181T组细胞内均有HBs表达,Western Blot结果显示181T组细胞内的HBs表达高于WT组和WT+181T组。ELISA检测3组细胞培养上清的HBs Ag水平差异有统计学意义(F=66.739,P0.001),其中181T组细胞外的HBs Ag水平(0.111±0.056)远远低于WT组(3.157±0.490)和WT+181T组(2.240±0.797)(P值均0.001);WT组、181T组和WT+181T组均可见LC3-Ⅱ自噬颗粒聚集,181T组LC3-Ⅱ表达水平高于WT组和WT+181T组,而P62水平低于WT组和WT+181T组,差异均有统计学意义(P值均0.05);181T组自噬相关基因Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA转录水平均明显高于WT组和WT+181T组(P值均0.05)。结论 HBV rtA181T突变可导致HBs Ag分泌障碍,并增加Huh7细胞的自噬水平。     

低氧微环境对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的观察低氧微环境对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响,并进一步探讨其可能机制。方法将胶质瘤细胞A172和U251分别置于普通细胞培养箱(常氧组:21%氧气含量)和低氧工作站(低氧组:2%氧气含量)中培养,采用CCK-8(Cell Counting Kit,CCK8)法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)和Sox2表达水平。结果低氧组胶质瘤细胞增殖和侵袭水平明显高于常氧组,且HIF-1α和Sox2表达水平也高于常氧组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论低氧微环境可能通过上调Sox2表达促进胶质瘤细胞A172和U251的增殖和侵袭。