持续低氧预处理促进兔尿源性干细胞增殖和减少凋亡

目的探讨持续低氧(3%O_2)环境对兔尿源性干细胞(r USCs)增殖、凋亡及分泌功能的影响。方法 r USCs分别置于3%O2和20%O_2条件下培养,连续观察其形态学变化,绘制细胞增殖曲线;检测其分泌、周期及凋亡变化。结果 r USCs原代培养约第6天便可见单个"米粒样"细胞,不同氧浓度培养后发现常氧组细胞为"长梭形",低氧组向"鹅卵石"样改变;两组细胞增殖曲线均呈"S"形,但低氧组增殖速度较快(P0.01);低氧组较常氧组相比,血管营养因子表达量均有上调且表达因子种类增加;常氧组G0/G1期细胞数为91.73%±1.35%,明显高于低氧组的71.82%±8.86%(P0.05);常氧组S期细胞数为3.48%±0.73%,显著低于低氧组的18.77%±3.87%(P0.01);流式常氧组凋亡率为3.24%±0.38%,明显高于低氧组的0.43%±0.05%(P0.001);Hoechst结果常氧组凋亡率为4.27%±0.48%,明显高于低氧组的1.37%±0.33%(P0.01)。结论持续性低氧(3%O2)环境可促进r USCs细胞的增殖,减少细胞凋亡,增加其分泌功能。     

携带siANGPTL4重组腺病毒的构建及其对MG63增殖的抑制作用

目的 应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带siANGPTL4基因的重组腺病毒,进一步研究ANGPTL4基因对骨肉瘤细胞株MG63增殖的影响.方法 将设计的siRNA靶点寡聚核苷酸克隆到pSES-HUS载体构建重组质粒pSES-siANGPTL4,在BJ5183大肠杆菌内与pAdEasy1骨架质粒完成同源重组;经...     

重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响

目的构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响。方法设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ。腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态。结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致。腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60%。其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P0.05)。ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P0.05)。结论成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化。     

β-catenin过表达对骨肉瘤细胞TE85迁移、侵袭及凋亡的影响

目的 探讨β-catenin对骨肉瘤细胞TTE85迁移、侵袭及凋亡的影响.方法 RT-PCR及Western blot检测β-catenin在不同骨肉瘤细胞中的表达情况,重组腺病毒Adβ-catenin感染TE85细胞,RT-PCR及荧光素酶报告基因检测感染Adβ-catenin后β-catenin mRNA的表达及活性,划痕实验检测迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力,DAPI染色和流式细胞技术检测细胞凋亡情况.结果 TE85细胞内源性β-catenin表达相对较低(P＜0.05),Adβ-catenin能显著增加TE85细胞外源性β-catenin基因表达及活性,β-catenin组细胞迁移能力明显减慢(P＜0.05),β-catenin组侵袭能力明显低于对照组(P＜0.05).结论 β-catenin能抑制肿瘤细胞TE85的迁移及侵袭能力,对凋亡无影响.     

骨形成蛋白信号分子在小鼠椎间盘发育中的表达

目的:探索促进成骨相关的骨形成蛋白(BMP)-2、-4、-6、-7、-9以及抑制成骨作用的BMP-3在小鼠不同年龄段椎间盘中表达情况,为椎间盘发育过程中BMP信号途径的研究奠定重要基础.方法:解剖获取出生后1d、3d、1周、1个月、3个月、6个月龄小鼠的椎间盘及胸腰椎脊柱.RT-PCR检测BMP-2、-3、-4、-6、-7、-9在生后不同年龄段小鼠椎间盘的表达情况,免疫印迹及免疫组织化学验证在RT-PCR中有明显表达差异的BMP-3、-6.结果:RT-PCR结果显示BMP-2、-7、-9的表达在小鼠椎间盘组织中有一定的基础表达,但随着年龄增大没有明显的变化趋势,而BMP-3和BMP-6的表达整体呈现出下降的趋势,BMP-4在椎间盘中无表达,免疫印迹及免疫组织化学结果也证实BMP-3和BMP-6随着小鼠椎间盘的发育表达降低.结论:正常小鼠脊柱,随着年龄的增加,椎间盘中BMP-2、-7、-9的表达无明显变化趋势,各年龄段都维持着一定量的表达,BMP-3和BMP-6的表达整体呈现出下降的趋势,具有明显成骨作用的BMP-4则没有表达.     

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。     

青少年特发性脊柱侧弯血液GH、IGF-1、IGFBP-3和E2的检测

[目的]探讨青少年特发性脊柱侧弯(AIS)患儿血液生长激素(GH)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、类胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、雌二醇(E2)的水平。[方法]118例AIS患儿,125例健康青少年作为对照。根据侧弯方向分为S型侧弯组(双向侧弯)、C型侧弯组(单向侧弯),再根据侧弯严重程度分为轻度(10°～20°)、中度(20°～40°)、重度(40°)。采用化学发光免疫分析法检测所有研究对象血清GH、IGF-1、IGFBP-3、E2水平,并与对照组进行比较分析。[结果]S型和C型侧弯患儿血清IGF-1、IGFBP-3水平与对照组相比明显降低(P0.05),血清GH、E2水平与对照组相比差异无统计学意义。C型侧弯的血清E2水平较S型侧弯显著增高(P0.05)。IGF-1、IGFBP-3与Cobb's角Pearson相关分析无统计学意义。C型侧弯的中、重度组血清GH水平较轻度组显著降低(P0.05)。C型侧弯的重度组血清E2水平较轻、中度组显著降低(P0.05)。[结论]IGF-1、IGFBP-3水平在患儿中表达低于正常者,提示可能是AIS发病因素之一。S型侧弯和C型侧弯骨代谢存在差异。GH、E2与AIS的关系仍有待进一步研究。     

大鼠siTLR4重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建特异性针对大鼠TLR4基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究TLR4在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。方法设计并合成3对大鼠TLR4基因的siRNA序列,退火处理后定向克隆到pSES-HUS穿梭质粒中,获得pSES-HUS-siTLR4,经Pme I线性化后与pAdEasy-1骨架质粒在BJ5183细菌中进行同源重组,从而构建pAd-siTLR4质粒,通过脂质体转染,在HEK293细胞中包装形成Ad-siTLR4腺病毒颗粒,用该病毒感染PC12细胞,从基因和蛋白质水平分别检测3对siTLR4的抑制效果,同时从蛋白质水平检测TLR4下游关键分子NF-κB的表达。结果 PCR、酶切和测序均证实目的基因正确克隆到所构建的pAd-siTLR4重组腺病毒载体中;经包装获得的Ad-siTLR4病毒颗粒在PC12细胞中能够有效地抑制TLR4 mRNA和蛋白水平的表达,并显著地降低了NF-κB的表达。结论成功构建了pAd-siTLR4重组腺病毒质粒,同时包装获得了Ad-siTLR4重组腺病毒,转染PC12细胞后不仅能明显降低TLR4的表达,而且有效地抑制了TLR4通路下游关键分子NF-κB的表达。     

视黄酸核受体α的siRNA重组腺病毒构建及干扰效果初步鉴定

目的:构建视黄酸核受体α(RARα)的siRNA重组腺病毒,为反向研究RARα受体在全反式视黄酸(ATRA)抗凋亡过程中的作用提供实用的技术手段.方法:设计3对大鼠RARα的siRNA序列,将其分别克隆到pSES-H US穿梭质粒;进而将重组穿梭质粒pSES-HUS-siRARα与pAdEasy-1在BJ5183感受态大肠埃希菌内同源重组以得到pAd-siRARα,Pac I酶切线性化后转染HEK293进行包装扩增以得到重组腺病毒Ad-siRARα;Ad-siRARα感染大鼠PC12细胞48 h,提取各组mRNA和总蛋白,Real-time PCR和免疫印迹检测Ad-siRARα-1、-2、-3对RARα的抑制效率.结果:PCR、酶切及测序均证实RARα的siRNA序列正确克隆至腺病毒质粒载体,经过包装扩增得到大量高滴度重组腺病毒Ad-siRARα,而且对RARα的表达抑制效率接近70％.结论:成功构建视黄酸核受体RARα的siRNA重组腺病毒,并具有下调PC12细胞RARα基因和蛋白表达的功能.     

Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的影响。方法：以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性变化、钙盐沉积、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨桥素（osteopontin,OPN）变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果：BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性（F=1 467.21,P=0.000）、钙盐沉积、OC（F=32.95,P=0.000）和OPN（F=127.23,P=0.000）蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论：Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。