胰腺癌细胞 BXPC-3转染条件的优化

目的：探讨实验室常用的人胰腺癌细胞株BXPC-3的有效转染方法及最佳转染参数。方法通过脂质体法和电穿孔法将表达绿色荧光蛋白的质粒（ pGFP-N3）导入人胰腺癌细胞株BXPC-3中,24 h后观察并比较细胞的存活率及瞬转效率,确定最佳转染参数。结果常规脂质体法BXPC-3细胞瞬转阳性率为1．36％,细胞存活率为87．45％;而电穿孔法在电压120 V电击时程70μs条件下,BXPC-3细胞瞬转阳性率为54．78％,细胞存活率为64．01％,2种转染方法的瞬转阳性率差异有统计学意义（P＜0．05）。结论转染BXPC-3细胞,电穿孔法可取得比常规脂质体法更高的转染效率。通过条件的优化,电穿孔法可以用于某些脂质体法难以有效转染的细胞株。     

电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响

目的通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索最佳的细胞转染方法和条件。方法以K562、Hep G2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒p CDNA3.1、p CDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达。结果当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,Hep G2细胞可以得到较高的转染效率。在K562细胞和Hep G2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P<0.05)。电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和Hep G2细胞的存活率显著低于脂质体法(P<0.05)。Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P<0.05)。结论最佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳。     

siRNA沉默survivin对人胃癌SGC-7901细胞生长的抑制作用

目的: 探讨siRNA沉默survivin基因表达对胃癌细胞生长的抑制作用及其机制,为胃癌及survivin阳性肿瘤的治疗提供理论依据。方法: 针对survivin　mRNA 序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个重组质粒pGCsilencerU6/GFP/survivin siRNA-１和-２;实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及survivin siRNA重组质粒转染治疗组,转染胃癌细胞SGC-7901,采用RT-PCR法检测survivin　mRNA的表达,Western blotting检测蛋白表达,观察重组质粒对其转染的SCG-7901细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: Western blotting、RT-PCR结果证实转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-1 的SCG-7901细胞survivin蛋白质及mRNA抑制率（78.25%及88.75%）均高于脂质体对照组（5%及2%）和空质粒对照组（1%及6%）（P<0.01）;转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-2的SCG-7901细胞survivin蛋白质及mRNA抑制率（42%及77%）也均高于脂质体对照组和空质粒对照组（P<0.01）;MTT法检测结果显示转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-1组细胞体外生长的抑制率（64%）高于空质粒对照组（11%）（P<0.01）;流式细胞术检测的转染重组质粒pGCsilenerU6/GFP/survivin-siRNA-1组细胞凋亡率（21.20±3.21）高于脂质体对照组（0.830±0.001）和空质粒对照组（1.98±0.67）（P<0.01）。结论:重组质粒pGCsilencerU6/GFP/survivin-siRNA可抑制胃癌细胞中survivin的表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。     

GFP质粒电转染SGC7901/ADM细胞的研究

目的 以电穿孔法,将GFP质粒转染SGC7901/ADM细胞,优化转染条件以得到较高的转染率.方法 在400μl电转染体系中,以不同的电场强度(150V、180V、210V和240V),脉冲时间(5ms、25ms、50ms和75ms),电场强度和脉冲时间(150V,75ms;180V,50ms;210V,25ms;240V,5ms),分别将GFP质粒电转染SGC7901/ADM细胞,并检测不同条件下细胞的存活率和转染率.结果 180V/50ms和210V/25ms的条件下,均能取得较好的电转染效果.     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌SGC7901细胞株凋亡的实验研究

目的 观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞株（SGC7901）增殖、凋亡的作用。方法 人工合成Survivin硫代ASODN，通过脂质体转染胃癌细胞株（SGC7901）后，用MTT法检测细胞毒作用；用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡；用RT-PCR、免疫组化技术检测SurvivinmRNA及蛋白的表达。结果 （1）Survivin ASODN抑制胃癌SGC7901细胞增殖呈时间和剂量依赖性；（2）Survivin ASODN处理组SGC7901细胞24h后凋亡率为33．6％，正义寡核苷酸（SODN）组为10．7％，2组相比，有显著性差异（P〈0．05）；（3）SurvivinASODN处理组SGC7901细胞Survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降。结论 Survivin ASODN能够抑制增殖、诱导凋亡，推测可能通过下调Survivin mRNA及蛋白表达而起作用。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

MDR1/MRP反义寡核苷酸逆转胃癌细胞耐药的研究

目的:探讨MDR1/MRP反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodooxynucleotide,ASODN)片段逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药(Multidrugresistance,MDR)的作用.方法:经MDR1或多药耐药相关蛋白(Multidrugresistance-asscociated protein,MRP)ASODN分别或联合转染SGC7901/ADM细胞后,采用RT-PCR法检测MDR1mRNA和MRPmRNA的表达.免疫细胞化学检测SGC7901/ADM细胞内p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、MRP的表达,流式细胞术检测瘤细胞内Rh123的潴留状况,MTT法检测瘤细胞对阿霉素、卡铂等抗癌药的敏感性.结果:SGC7901/ADM细胞经ASODN转染12h后,MDR1和MRP mRNA的表达均降低,转染24h后下降最明显,48h后恢复至转染前水平.经转染ASODN48h后,SGC7901/ADM细胞P-gp、MRP的表达显著下降,瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于转染前,且联合转染MDR1和MRP ASODN后瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于单纯转染组.SGC7901/ADM细胞在联合转染MDR1和MRP ASODN后对阿霉素、卡铂等化疗药物的敏感性明显高于单纯转染ASODN.结论:分别转染MDR1或MRP ASODN可部分逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药,而联合转染2种ASODN则可显著提高瘤细胞耐药逆转效率.     

RN Ai对胃癌SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响

目的：运用RNA干扰（RNAi）技术抑制HER2基因的表达,探讨其对胃癌SGC‐7901细胞侵袭及迁移能力的影响。方法设计、构建RNAi片段靶向抑制HER2高表达的胃癌细胞株（HER2‐RNAi组）,以转染阴性对照系列（阴性对照组）及未转染的SGC‐7901细胞（空白对照组）为对照组。利用RT‐PCR和Western blot法检测各组胃癌SGC‐7901细胞中 HER2的表达情况;采用Transwell小室模型及划痕实验检测RNAi对胃癌细胞体外的侵袭和迁移能力的影响。结果 RNAi片段转染后SGC‐7901细胞的HER2 mRNA和蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）;侵袭实验结果显示,HER2‐RNAi组的穿膜细胞数[（31．5±3．8）个／视野]显著低于未转染组[（103．6±4．5）个／视野];迁移实验结果显示,HER2‐RNAi组的穿膜细胞数[（63．6±5．1）个／视野]显著低于未转染组[（193．5±6．2）个／视野],各组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 RNAi沉默 HER2基因可以抑制胃癌SGC‐7901细胞的侵袭和迁移能力,提示RNAi基因沉默技术有可能成为进展期胃癌治疗的新方法。     

Transfection of HBV X gene into human liver cell line L02 and its effect on CⅡTAand HLA-DR expression

目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.     

生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。方法 设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组：空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降；ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）；ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下凋生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

内毒素对睾丸功能影响的研究进展

众所周知生殖道感染、炎症和其他疾病可抑制雄性生殖功能,但对系统性炎症和疾病引起男性不育的具体机制却所知甚少。内毒素是一种高效炎症激活物,可诱导炎症感染、内毒素血症、败血症休克及多组织器官损伤等,虽然内毒素广泛用于其他系统的炎症研究,但对其在生殖系统炎症的研究较少,因而深入了解内毒素对睾丸功能的影响,有助于进一步理解内毒素所致疾病对雄性生殖功能的影响。本文就内毒素的结构和生物学功能及其对睾丸生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞功能的影响进行了相关研究。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

莪术醇对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的研究莪术醇对人胃癌SGC-7901细胞生物学特性的影响。方法用MTT法测定莪术醇对SGC-7901细胞增殖的影响,流式细胞仪检测莪术醇对SGC7—901细胞周期和细胞凋亡的影响。结果10、30、100μg／mL莪术醇均能够抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖;莪术醇能使S和G2／M期肿瘤细胞比例减少,G0／G1期肿瘤细胞比例增加,其中100μg／mL浓度的莪术醇作用最强（F=88．14,P〈0．01）;莪术醇诱导肿瘤细胞凋亡,其中100μg/mL浓度的莪术醇凋亡作用最强（F=34．14,P〈0．01）。结论莪术醇诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

免疫性肝损伤大鼠枯否细胞对肝星状细胞增殖的影响及芍药苷的作用

目的探讨芍药苷(Pae)通过免疫性肝损伤大鼠枯否细胞(KC)影响肝星状细胞(HSC)的增殖能力。方法用卡介苗加脂多糖诱导大鼠肝损伤模型,肝脏原位灌流分离大鼠KC和HSC,观察共培养的形态学改变,观察Pae作用后的KC培养上清对HSC增殖的影响。结果免疫性肝损伤大鼠KC能明显促进HSC的增殖,在Pae作用后,KC培养上清能抑制HSC的增殖。结论KC是Pae发挥作用的靶细胞之一,Pae可通过作用于KC抑制HSC的增殖。