PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂在胰腺癌中是否有作用?

目的探讨PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂(STI571)在胰腺癌中的应用及机制.方法应用MTT方法检测胰腺癌细胞的生长情况,应用FACS(PI染色及Annexin染色)分析胰腺癌细胞的周期改变、凋亡发生及细胞的死亡机制.应用Western blot检测MAPK磷酸化与生长因子受体磷酸化水平.结果STI571在胰腺癌中的GI50是17～31.5μmol·L-1,EGF、FGF-2与IGF-1均可刺激胰腺癌细胞的生长,STI571仅能部分阻断生长因子的作用.STI571对MAPK与生长因子受体磷酸化并无影响,对细胞周期亦无影响.结论STI571对胰腺癌细胞的生长抑制作用不是通过酪氨酸激酶受体途径实现的,其具体机制及临床应用尚待进一步研究.     

人成纤维细胞生长因子1-Ⅲb受体亚型在胰腺导管细胞增殖中的作用及对蛋白激酶的调节

目的探讨人类成纤维细胞生长因子受体1的Ⅲb亚型（FGFR1-Ⅲb）在TAKA-1胰腺导管细胞增殖中的作用及对有丝分裂激活的蛋白激酶（MAPK）的调节。方法以脂质体法将人类全长FGFR1-Ⅲb表达质粒pSVK4／FGFR1-Ⅲb稳定转染入TAKA-1胰腺导管细胞,采用Western印迹、Northern印迹、免疫荧光和糖基化分析等方法鉴定FGFR1-Ⅲb在TAKA-1细胞中的表达、分布和结构特征,并以生长因子刺激转染细胞,通过MTY法及MAPK分析,观察FGFR1-HIb受体在胰腺导管细胞中的功能及作用机理。结果FGFR1-Ⅲb受体是位于120000和130～150000之间的糖基化受体,在细胞膜表面和胞浆中为中等强度表达,在胞浆的核周围区为高表达,细胞核内不表达。FGF-1、-2和-4能够明显促进转染FGFR1-Ⅲb基因的TAKA-1细胞的生长,同时能够明显增强p44／p42MAPK的磷酸化。结论人类FGFR1-Ⅲb受体在胰腺导管细胞中为功能性受体,FGF-1、-2和4能够促进转染FGFR1-Ⅲb基因的TAKA-1细胞的增殖,其机制为促进p44／p42MAPK的磷酸化。     

稳定沉默GLI1基因的人胰腺癌细胞株的建立

目的建立稳定转染GLI1siRNA表达质粒的人胰腺癌细胞株,并鉴定其干扰效率。方法采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测5株人胰腺癌细胞中GLI1基因的表达,筛选出GLI1基因表达量最高的细胞作为目标转染细胞。脂质体转染法将构建好的3个干扰质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3分别转染入目标细胞,G418抗性筛选阳性克隆,荧光显微镜下观察转染效率。采用qRT-PCR法和蛋白质印迹法检测各组稳定转染细胞中GLI1mRNA及蛋白的表达水平,鉴定干扰效率。结果筛选出GLI1基因表达量最高的Panc-1细胞株作为目标转染细胞;3个干扰质粒均成功转染Panc-1细胞,G418筛选后获得稳定转染细胞Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3,荧光显微镜下可见3个质粒的转染效率均在80%以上;qRT-PCR及蛋白质印迹检测证实Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3细胞中GLI1mRNA和蛋白的表达水平均显著低于阴性对照质粒(Panc-1/siControl)转染细胞及空白对照细胞(P<0.05),其中Panc-1/GLI1siRNA-1细胞表达量最低。结论成功构建了稳定沉默GLI1基因表达的胰腺癌细胞株Panc-1/GLI1siRNA-1,为后续研究奠定了基础。     

细胞免疫荧光检测人胰腺癌干细胞Oct4､Nanog基因的表达

目的:研究胚胎干细胞相关基因Oct4和Nanog在人胰腺癌肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞中表达的差异?方法:用流式细胞仪在人胰腺癌Panc-1细胞系中分选肿瘤干细胞,细胞免疫荧光法检测2种肿瘤干细胞和Panc-1细胞中Oct4?Nanog基因的表达情况?结果:Oct4及Nanog基因在2种分选出的细胞中表达均高于未分选细胞?结论:干细胞相关基因Oct4?Nanog在胰腺癌Panc-1肿瘤干细胞中的表达高于普通胰腺癌细胞?     

5，7-二甲氧基黄酮下调FoxMl基因表达对胰腺癌细胞上皮-间充质转化的影响

目的：探讨5,7二甲氧基黄酮（5,7-DMF）对胰腺癌细胞上皮-间充质转化的影响及分子机制。方法：用不同浓度DMF处理人胰腺癌Panc-1细胞,利用划痕法检测5,7-DMF干预后Panc-1细胞侵袭转移能力变化;用Western blot检测5,7-DMF干预后FoxM1蛋白表达情况;FoxM1siRNA转染人胰腺癌Panc-1细胞后,用Western blot进而检测 EMT相关上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子N-cadherin蛋白水平的表达变化。结果：5,7-DMF以浓度依赖方式显著抑制Panc-1细胞侵袭转移能力。5,7-DMF干预胰腺癌细胞后显著下调FoxM1表达水平;FoxM1 siRNA转染胰腺癌细胞,EMT相关分子E-cadherin表达升高,而N-cadherin表达降低,且与对照组相比均有统计学意义。结论：5,7二甲氧基黄酮可逆转胰腺癌细胞上皮-间充质转化,可能通过下调FoxM1水平是其重要机制之一,但其内在的分子机制尚需进一步探讨。     

p14ARF、p53抑癌基因与胰腺癌发生、发展的相关研究

目的:研究抑癌基因p14ARF、p53在胰腺癌组织中的表达和胰腺癌细胞株PC-3转染p14ARF基因前后的生长状况,探讨它们对胰腺癌发生、发展的影响.方法:采用免疫组织化学法检测10例正常胰腺组织、42例胰腺癌组织中p14ARF蛋白、p53蛋白的表达.将外源性p14ARFcDNA重组质粒pCI-neo-p14ARF和空载体质粒pCI-neo分别转染入胰腺癌PC-3细胞中,观察转染后胰腺癌PC-3细胞株的生长状况.结果:正常胰腺组织中p14ARF的表达率为90%,胰腺癌组织中为35.7%;正常胰腺组织中p53的表达率为0,胰腺癌组织中为45.2%.胰腺癌PC-3细胞的p14ARF基因呈缺失变异.外源性野生型p14ARF基因和空载体质粒pCI-neo成功转染入PC-3细胞,转染p14ARF基因的胰腺癌细胞株第1天生长抑制率为22%,第5天为26%.结论:抑癌基因p14ARF蛋白在胰腺癌中低表达,突变型p53蛋白在胰腺癌中呈高表达;转染p14ARF基因的胰腺癌细胞株生长受到抑制;抑癌基因p14ARF、p53对胰腺癌的发生、发展可能产生影响.     

LncRNA CTD-3252C9.4抑制人胰腺癌Panc-1细胞体外侵袭迁移的机制

研究长链非编码RNA(lncRNA)CTD-3252C9.4对人胰腺癌细胞Panc-1体外迁移和侵袭的抑制作用及其机制。采用培养胰腺癌微球体的三维半固体体系中的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激培养Panc-1细胞;采用RT-qPCR检测lncRNA CTD-3252C9.4在Panc-1中的表达量和载体转染效率;采用划痕-愈合法和Transwell小室法检测lncRNA CTD-3252C9.4及其靶基因骨形态发生蛋白7(bone morphogenetix protein 7,BMP7)对Panc-1细胞侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot验证靶基因BMP7和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白表达量的变化。结果表明:EGF能显著抑制Panc-1中lncRNA CTD-3252C9.4的表达,且该lncRNA能够通过抑制促癌基因BMP7的转录影响细胞侵袭和迁移能力,并且抑制肿瘤的EMT过程。     

Survivin特异性siRNA增强人胰癌细胞株Panc-1对顺铂的敏感性

目的 探讨Survivin 特异性siRNA对人胰癌细胞株Panc-1顺铂敏感性的影响.方法 体外将Survivin特异性siRNA表达载体pSurvivin-siRNA转染人胰癌细胞株Panc-1,应用RT-PCR、蛋白印迹法(Western blot) 检测转染siRNA后Panc-1细胞Survivin基因和蛋白的表达变化,应用MTT法检测干扰Survivin后Panc-1细胞对顺铂敏感性的变化.结果 转染Survivin特异性siRNA后,Panc-1细胞Survivin基因和蛋白的表达水平明显下降;顺铂对Panc-1细胞的半数抑制量从(11.992 7±1.147 0)μg/ml下降到(1.238 2±0.085 7)μg/ml,Panc-1细胞对顺铂的敏感性增加了9.69倍.结论 Survivin特异性siRNA抑制Survivin表达,能增加人胰癌细胞株Panc-1对顺铂的敏感性.     

Tjp-2沉默增强胰腺癌细胞解离及侵袭能力

目的采用Tjp-2siRNA转染仓鼠胰腺癌细胞,验证Tjp-2在胰腺癌细胞解离及侵袭中的作用。方法利用脂质体介导法将Tjp-2siRNA转染仓鼠胰腺癌低转移株PC-1细胞,实验分为转染组、阴性对照组、对照组。RT-PCR检测3组胰腺癌细胞中Tjp-2mRMA及蛋白表达水平并分析转染效率,用Papanicolaou′S染色法观察细胞解离状态,Transwell小室方法分析Tjp-2基因siRNA转染后胰腺癌细胞侵袭能力的变化。结果经过Tjp-2基因特异性siRNA转染后,PC-1细胞解离状态开始从岛样克隆生长改变为单个散在生长,其侵袭能力明显增强。结论 Tjp-2的表达与胰腺癌细胞解离状态及侵袭能力密切相关,Tjp-2表达降低可增强胰腺癌细胞的侵袭能力。Tjp-2可作为抗胰腺癌侵袭转移分子靶向治疗的新靶点。     

表皮生长因子诱导人胰腺癌细胞SW1990中人宫颈癌基因的表达及其机制

目的研究表皮生长因子（EGF）诱导人胰腺癌细胞SW1990中人宫颈癌基因（HCCR）蛋白表达的分子信号通路机制。方法 100 ng/ml EGF作用SW1990细胞不同时间后,用Western blot检测其磷酸化AKT和HCCR蛋白表达情况;用LY294002（PI3K/AKT抑制剂）预处理SW1990细胞后用EGF作用SW1990细胞,观察其HCCR蛋白表达情况。结果 Western blot结果显示,与对照组相比,细胞内磷酸化AKT表达水平在4h时明显升高（P〈0.05）,而HCCR表达水平则随着EGF处理时间增加而升高（P〈0.05）;LY294002（PI3K/AKT抑制剂）可阻断EGF诱导的HCCR蛋白表达。结论 EGF通过PI3K/AKT通路诱导人胰腺癌细胞SW1990中HCCR蛋白的表达,这一通路可被PI3K/AKT抑制剂阻断。     

胰岛素样生长因子-1与血小板源生长因子-AA以及肿瘤生长因子β1基因克隆及其在腺病毒载体中的表达

目的 从正常的人体成骨细胞中克隆IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1三因子的编码蛋白基因,构建上述因子基因的高效表达重组腺病毒,旨在为基因治疗研究提供有效的工具。方法 培养正常人体成骨细胞,提取细胞总RNA,RT—PCR方法获得IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1的编码基因。将这些片段克隆到高效表达腺病毒载体Adeno—X,并经过HEK293细胞的包装,获得成熟的重组腺病毒。Western印迹法检测上述三因子的表达。利用成熟重组腺病毒感染成骨细胞,检测细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性的改变。结果 重组T载体、重组腺病毒DNA和成熟的重组腺病毒体中均可得到IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1基因的PCR片段。Western印迹检测到上述3种因子蛋白质的表达。当携带上述3种因子的重组腺病毒感染成骨细胞后,细胞增殖明显增强,ALP活性明显提高。结论 本实验构建的IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1因子的高效表达重组腺病毒可以在人体细胞中表达出具有生物活性的蛋白质,获得了较好的基因工具。     

野生型p53基因转染对人胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用

目的 研究野生型p53基因对人未分化胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用。方法 用表达人野生型p53基因全长cDNA的真核载体pcDNA3—p53，转染人未分化胃癌细胞系HGC27，对转染后细胞进行生长曲线、细胞生长抑制率及流式细胞术分析，观察其生物学特性变化。结果 外源野生型p53基因在HGC27细胞内稳定表达，经pcDNA3—p53转染的HGC27细胞生长速度受到明显抑制，流式细胞分析显示G1期增加，S期下降，细胞出现凋亡。结论 野生型p53基因能在HGC27细胞内表达，且能抑制其生长并促进细胞凋亡。     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

The effects of antisense PTEN gene transfection on the growth and invasion of glioma cells

Objective:To study the effects of antisense PTEN gene on the growth and invasion of glioma cells. Methods: A pcDNA3. 1/Hygro(-) recombinant plasmid containing antisense PTEN gene fragment was constructed. Glioma cells of primary culture were transfected with antisense PTEN gene vector and stably transfected clones were selected. Then, the different growth and invasion abilities and the different MMP9 mRNA expressions of three kinds of cells were observed, including the transfected cells, untrans-fected cells and the cells transfected with empty vector. Results:The abilities of growth and invasion of the transfected cells and the expressions of MMP9 mRNA were obviously enhanced. Conclusion: Antisense PTEN gene could have a negative impact on the growth and invasion of primary culture glioma cells.     

靶向表皮生长因子受体的小分子干扰RNA抑制TJ905人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的实验研究

目的　比较靶向表皮生长因子受体 (EGFR)的小分子干扰RNA与反义RNA构建体对TJ90 5人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法　选择人EGFR的二个siRNA靶序列构建靶向EGFR的siRNA表达质粒 ,并以反义EGFRRNA为对照进行脂质体介导的TJ90 5人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用免疫荧光和蛋白印迹检查EGFR的表达水平 ;应用TUNEL法分析细胞凋亡 ,流式细胞术分析细胞周期变化 ,MTT法分析细胞增殖 ;蛋白印迹检测基质金属蛋白酶 9的表达 ,明胶酶谱分析MMP9酶活性 ,Transwell法分析侵袭能力。结果　与TJ90 5细胞和转染空载体的TJ90 5细胞比较 ,转染反义EGFRRNA使EGFR表达下调 82 % ,转染siRNA表达质粒组EGFR表达下调 90 %和 92 %。TJ90 5组和空载转染组几乎没有凋亡细胞 ,反义EGFR转染组与siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加 ( χ2 =31 5 4 9,P <0 0 0 1) ;siRNA表达载体转染后S期指数较对照和反义RNA转染组细胞明显减少 ,与TJ90 5组和空载转染组比较 ,转染组细胞自第 1天起存活率均明显下降 (P <0 0 0 1) ,且反义组与siRNA表达载体转染组之间存活率差异有显著意义 (P <0 0 1) ;同时蛋白印迹发现转染siRNA表达载体后MMP 9的表达明显下调 ,明胶酶谱分析发现在反义组与siRNA表达载体转染组MMP 9酶活性明显下降 ,以siRNA     

CBP基因对肺鳞癌NCI-H520细胞生长侵袭的抑制作用

目的:研究CSK结合蛋白(CSK-binding protein, CBP)基因转染对人肺鳞癌NCI-H520细胞体外生长侵袭的影响?方法:构建CBP真核表达质粒pcDNA3.0-CBP,以脂质体转染法转染体外培养的人肺鳞癌细胞株NCI-H520,G418筛选出抗性克隆?Western-blotting和RT-PCR分别检测转染前后CBP蛋白和mRNA水平的变化,MTT法分析细胞生长抑制作用,Transwell体外侵袭实验和Wound-healing实验观察细胞的侵袭和迁移能力?结果:稳定转染CBP基因的细胞株有外源目的基因的整合和相应蛋白的高表达?MTT检测表明,pcDNA3.0-CBP转染组活细胞数低于未转染组和pcDNA3.0(-)空载体质粒细胞转染组(P < 0.01)?细胞侵袭?迁移实验表明转染pcDNA3.0-CBP的瘤细胞侵袭与迁移能力均明显下降(P < 0.01)?结论:外源性CBP基因稳定转染可抑制人肺鳞癌NCI-H520细胞增殖?侵袭的恶性表型?     

外源性p16基因对人前列腺癌的作用

目的:研究外源性p16基因对人前列腺癌PC-3M细胞系生长及致瘤性的抑制作用,探索前列腺癌基因治疗的新途径.方法:利用携带约800 bp的外源性p16 cDNA的真核表达质粒,通过脂质体介导将其导入人前列腺癌PC-3M细胞系中,用G418筛选阳性克隆,经流式细胞仪及细胞生长曲线测定等方法研究p16基因对人前列腺癌细胞周期生长特性的影响,并观察导入外源性p16基因的人前列腺癌细胞PC-3M对裸鼠致瘤能力的影响.结果:野生型p16基因转染到有p16基因缺失的人前列腺癌细胞PC-3M上,细胞周期明显变化,细胞从G1期到S期发生抑制,细胞增殖活性降低.结论:转染外源性p16基因可阻止人前列腺癌细胞由G1期进入S期,并使肿瘤恶性增殖受到抑制.     

下调TSG101基因对人结肠癌细胞LOVO生长的调节作用

目的:探讨TSG101基因对人结肠癌细胞生长的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入LOVO细胞,获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和western blot进行鉴定;MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化;Western blot检测细胞转染前后细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6、p21和p27的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体;筛选到稳定的TSG101低表达的结肠癌细胞模型;转染TSG101小干扰RNA后的细胞生长速度显著减慢,出现G1期阻滞,且Cyclin D1的表达明显降低,p21的表达明显增高。结论:下调TSG101基因能抑制结肠癌细胞生长,提示该基因可能具有临床应用前景。     

外源性PTEN基因稳定转染对大肠癌LS1747细胞周期及凋亡的影响

目的 :研究外源性基因PTEN对人类大肠癌LS174 7细胞周期及凋亡的影响。方法 :以携带有PTEN基因的真核表达载体体外转染人类大肠腺癌细胞LS174 7,筛选阳性克隆的细胞并扩增培养 ,鉴定转染成功后采用流式细胞仪、透射电镜、DNA琼脂糖电泳 ,检测转染PTEN基因后LS174 7细胞的凋亡以及观察三种细胞生长曲线。结果 :流式细胞仪显示 ,细胞周期从G1期到S期发生抑制 ,并在G1期峰前出现 1个明显的凋亡峰。透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞浆浓缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现。细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带。转染空载体及未转染的LS174 7细胞未见凋亡表现。转染PTEN的LS174 7细胞与空白质粒载体转染的LS174 7细胞和LS174 7细胞的生长速度相比 ,后两者生长速度较快。结论 :将外源性PTEN基因导入LS174 7细胞后 ,可以抑制细胞周期 ,并可诱导细胞凋亡 ,这可能是PTEN基因抑制大肠癌细胞增殖的重要机制之一。