Gli1小分子干扰RNA对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究锌指转录因子Gli1小分子干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌PC-2细胞的增殖和凋亡的影响。方法:筛选出最佳的靶向Gli1siRNA转染人胰腺癌PC-2细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测抑制效果,四甲基偶氮唑蓝(MTT)和TUNEL+PI双染流式细胞检测Gli1被抑制后细胞增殖和细胞凋亡的情况。结果:Gli1siRNA能在mRNA和蛋白水平下调人胰腺癌细胞株PC-2中Gli1基因的表达,以转染72h时最显著。Gli1表达被抑制后,转染后72h时PC-2细胞生长受到明显抑制,凋亡细胞显著增多。结论:Gli1与胰腺癌细胞的生长和凋亡密切相关,抑制胰腺癌细胞中Gli1表达可抑制胰腺癌细胞生长,促进胰腺癌细胞凋亡。     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对人胰腺癌细胞SW1990侵袭能力的影响

目的：观察信号转导与转录因子3（STAT3）siRNA表达载体对胰腺癌细胞侵袭能
力的影响,并探讨其机制。方法：实验分为空白对照组、阴性对照组及STAT3 siRNA组。以人
胰腺癌细胞株SW1990作为研究对象,将合成的STAT3 siRNA转染SW1990细胞后,采用RT-PCR及
Western blotting检测转染前后STAT3 mRNA及蛋白的表达变化,Transwell法检测其对胰腺癌
细胞侵袭能力的影响,RT-PCR及Western blotting检测其对胰腺癌细胞MMP-2和MMP-9表达
的影响。结果：STAT3 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,STAT3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低,
与空白对照组及阴性对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;转染后胰腺癌细
胞的侵袭细胞数及MMP-2和MMP-9的表达显著减小,与阴性对照组及空白对照组比较,差异有统
计学意义（P<0.05）。结论：STAT3 siRNA能特异地阻断胰腺癌细胞中STAT3信号的活
化,并进一步通过下调MMP-2和MMP-9的表达从而抑制胰腺癌细胞的侵袭能力。     

p14ARF、p53抑癌基因与胰腺癌发生、发展的相关研究

目的:研究抑癌基因p14ARF、p53在胰腺癌组织中的表达和胰腺癌细胞株PC-3转染p14ARF基因前后的生长状况,探讨它们对胰腺癌发生、发展的影响.方法:采用免疫组织化学法检测10例正常胰腺组织、42例胰腺癌组织中p14ARF蛋白、p53蛋白的表达.将外源性p14ARFcDNA重组质粒pCI-neo-p14ARF和空载体质粒pCI-neo分别转染入胰腺癌PC-3细胞中,观察转染后胰腺癌PC-3细胞株的生长状况.结果:正常胰腺组织中p14ARF的表达率为90%,胰腺癌组织中为35.7%;正常胰腺组织中p53的表达率为0,胰腺癌组织中为45.2%.胰腺癌PC-3细胞的p14ARF基因呈缺失变异.外源性野生型p14ARF基因和空载体质粒pCI-neo成功转染入PC-3细胞,转染p14ARF基因的胰腺癌细胞株第1天生长抑制率为22%,第5天为26%.结论:抑癌基因p14ARF蛋白在胰腺癌中低表达,突变型p53蛋白在胰腺癌中呈高表达;转染p14ARF基因的胰腺癌细胞株生长受到抑制;抑癌基因p14ARF、p53对胰腺癌的发生、发展可能产生影响.     

蛋白激酶B siRNA转染胃癌SGC-7901细胞对其侵袭能力的影响

目的研究蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）小干扰RNA（siRNA）转染人胃癌SGC-7901细胞,探讨转染后抑制癌细胞转移侵袭的可行性．方法应用基因转染技术将蛋白激酶基因片段转染至胃癌SGC-7901细胞中,采用Millicell小室、集落形成实验、流式细胞术等方法观察蛋白激酶B siRNA转染后对转染组细胞侵袭力的影响．结果与对照组比较转染组的胃癌SGC-7901细胞克隆增殖速度和侵袭能力明显减弱（P〈0．01）,提示转染组siRNA能特异性抑制蛋白激酶B基因的活化,即蛋白激酶B基因的siRNA片断可抑制胃癌SGC-7901细胞的克隆增殖和癌细胞转移侵袭．结论应用RNAi使蛋白激酶B基因沉默能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞的克隆生长,并在一定程度上阻止了癌细胞的侵袭和转移,其作用机理值得进一步的深入研究．     

PKIB表达对胰腺癌细胞增殖与侵袭影响的实验研究

目的:人cAMP依赖型蛋白激酶B抑制剂(cAMP-dependent protein kinase inhibitor-β,PKIB)表达对胰腺癌细胞增殖与侵袭的影响。方法:利用Lipofectamine~(TM)2000转染PKIB过表达和沉默基因至PANC-1胰腺癌细胞,应用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法与蛋白质印迹法(Western blot)检测转染细胞中PKIB mRNA与蛋白的表达。应用噻唑蓝(MTT)比色法和结晶紫实验检测胰腺癌细胞活力和增殖能力,应用Transwell实验测定胰腺癌细胞的侵袭能力。结果:胰腺癌细胞的PKIB表达高于正常胰腺导管上皮细胞(P<0.05)。PKIB过表达增强细胞活力(P<0.05),促进细胞增殖,使胰腺癌细胞侵袭能力增强(P<0.05),而沉默PKIB表达对胰腺癌细胞的生物学效应恰好相反(P<0.05)。结论:PKIB的表达程度可影响胰腺癌细胞的增殖和侵袭,为进一步探讨胰腺癌发病机制及治疗提供有力证据。     

siRNA下调Ezrin表达对人胰腺癌PANC-1细胞增殖和运动能力的影响

目的:探讨Ezrin蛋白在胰腺癌细胞生长和运动转移过程中的作用。方法:体外培养人胰腺癌PANC-1细胞,针对Ezrin基因设计小干扰RNA(siRNA),并通过脂质体转染入细胞,运用MTT法、流式细胞仪、划痕愈合实验、扫描电镜和Transwell实验方法,观察siRNA下调人胰腺癌PANC-1细胞Ezrin表达后,肿瘤细胞增殖、细胞周期、伪足形成、侵袭和迁移能力的改变。结果:Western印迹分析结果显示,Ezrin siRNA对Ezrin蛋白表达水平有显著的下调作用。下调Ezrin蛋白表达后,PANC-1细胞增殖明显被抑制,G2/M期细胞显著降低;细胞伪足形成显著减少,细胞的运动侵袭能力下降。结论:Ezrin在胰腺癌细胞恶性增殖和运动转移过程中具有重要作用,可能成为抑制胰腺癌侵袭转移的靶点。     

VEGF-C-siRNA对人肺癌细胞A549生物学行为的影响

目的 初步探讨靶向VEGF-C基因的siRNA转染肺癌细胞A549后对其生物学行为的影响.方法 构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒并转染A549细胞,免疫印迹法检测蛋白的表达水平,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性.结果 成功构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒.VEGF-C-siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱,生长抑制率明显高于阴性对照组(P＜0.01),且表现出时间依赖性.结论 靶向VEGF-C的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制肿瘤细胞增殖.     

siRNA沉默PRL-3基因对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的作用

目的探讨小干扰RNA沉默PRL-3基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭及增殖的影响。方法化学合成PRL-3基因的特异性siRNA,脂质体转染法转染PC-3细胞;24及48小时行real-time PCR和Western blotting验证其沉默效果;Tran-swell侵袭实验检测其体外侵袭力的改变;CCK8检测其增殖能力。结果转染siRNA后,与对照组相比较,siRNA干扰组mRNA水平抑制率达60%以上,蛋白水平抑制率达90%以上,且在48h达到最佳抑制效果(P<0.05,P<0.05);PC-3细胞穿过基膜数明显减少(P<0.05),但是对细胞生长抑制作用不明显。结论应用RNA干扰技术沉默人前列腺癌PC-3细胞中的PRL-3基因,可以抑制PC-3细胞的侵袭能力,为进一步探讨前列腺癌的发病机制奠定一定的实验基础。     

RhoC基因表达与前列腺癌细胞系侵袭行为相关性的体外研究

目的 研究RhoC基因在不同转移潜能前列腺癌细胞系中的表达及其与前列腺癌侵袭行为的相关性.方法 利用逆转录聚合酶链反应、Western印记方法检测前列腺癌不转移亚系(PC-3M-284)和高转移亚系(PC-3M-1E8)细胞中RhoC mRNA和蛋白表达水平;构建RhoC基因真核表达载体转染前列腺癌不转移亚系PC-3M-2B4;利用Matrigel胶穿膜侵袭实验检测转染后细胞的体外侵袭能力、划痕修复实验检测运动迁移能力、组织化学染色检测微丝骨架结构的变化、明胶酶谱分析基质金属蛋白酶(MMP)活性变化,并利用Western印记检测Akt信号传导通路磷酸化水平变化.结果 RhoC在两种不同转移能力前列腺癌细胞系中不同程度表达,在高转移亚系中高表达,不转移亚系中低表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).基因转染过表达RhoC后前列腺癌细胞的体外侵袭能力明显增强,正义转染组(125.21±10.43)与其相应空载体组(53.77±8.56)、反义组(46.22±8.12)和未转染对照组(57.68±7.25)相比,穿膜细胞数明显增多(P＜0.01);运动迁移能力明显增强,正义转染组16 h划痕修复率(62.38±2.36)明显高于转染空载体组(32.23±2.43)、反义组(29.47±1.86)和未转染对照组(31.88±2.67)(P＜0.01);组织化学染色显示正义转染组细胞内肌动蛋白多聚体减少,微丝骨架杂乱、模糊;此外,RhoC基因正义转染组细胞MMP-2活性上调,p-Akt水平升高.结论 RhoC基因过表达促进前列腺癌细胞的体外侵袭能力,并与前列腺癌细胞系转移潜能正相关,有望成为阻断前列腺癌转移的治疗新靶点.     

MSP58沉默对肺癌细胞A549细胞生物学行为的影响

目的:探讨沉默MSP58基因对肺癌细胞A549增值,细胞周期和侵袭能力的影响。方法:化学合成针对MSP58基因的siRNA,转染肺癌细胞A549,RT-PCR和Western-blot检测MSP58基因的mRNA和蛋白水平,利用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,Transwell小室实验观察侵袭能力。结果:针对MSP58基因的siRNA转染A549细胞48h后,与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA组显著降低MSP58的基因表达和蛋白表达,细胞的增值受到抑制,并随着时间延长抑制明显,细胞发生G1期阻滞,细胞的侵袭力下降。结论:利用特异性siRNA沉默MSP58基因的表达,可以显著抑制肺癌A549细胞增值和侵袭能力,MSP58有可能成为肺癌治疗的新靶点。     

靶向封闭CapG基因对胰腺癌细胞运动侵袭能力的影响

目的观察靶向封闭CapG基因对胰腺癌细胞株BxPC3运动侵袭能力的影响。方法设计并体外合成靶向CapG的小干扰RNA,将其转染到BxPC3细胞中,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中CapG蛋白的表达,采用Transwell小室检测转染前后细胞运动侵袭能力的改变。结果CapGsiRNA能有效降低BxPC3细胞中CapG的表达,CapG在蛋白质水平的表达抑制率达80％左右。抑制BxPC3细胞中CapG的表达后,BxPC3细胞的运动侵袭能力明显下降,穿过人工基底膜的细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）。结论封闭CapG表达能明显抑制胰腺癌细胞BxPC3在体外的运动侵袭能力。     

沉默SLP-2 可抑制人宫颈癌细胞的迁移及侵袭能力

目的研究沉默SLP-2对人宫颈癌细胞迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法用siRNA转染人宫颈腺癌Hela细胞 及宫颈鳞癌Siha细胞作为沉默组,同时设立空白对照组及阴性对照组,转染48 h后,用Western blot检测SLP-2蛋白的表达量, 用划痕实验、Transwell 实验检测沉默SLP-2 对Hela 和Siha 细胞迁移能力的影响,用基质胶Transwell 实验检测沉默SLP-2 对 Hela 和Siha 细胞侵袭能力的影响,用Western blot 检测沉默SLP-2 后Hela 和Siha 细胞上皮间质转化标志分子E-cadherin、β- catenin、vimentin及上皮间质转化上游转录因子Twist蛋白表达量的变化。结果与对照组相比,Western blot结果显示沉默组 SLP-2蛋白的表达量明显下降;划痕实验显示沉默组的划痕面积愈合率明显下降（P<0.01）;Transwell实验及基质胶Transwell实 验均显示沉默组穿过小室膜至下室的细胞数明显减少（P<0.01）;Western blot结果显示沉默组上皮细胞标志分子E-cadherin及 β-catenin表达升高,而间质细胞标志分子vimentin表达下降,表明Hela细胞和Siha细胞的上皮间质转化受到抑制;Western blot 结果显示沉默组Twist蛋白的表达量也明显下调。结论沉默SLP-2可抑制人宫颈癌细胞上皮间质转化（EMT）的发生,使宫颈 癌细胞的迁移及侵袭能力下降,其作用机制可能与下调Twist蛋白的表达有关。     

沉默CXCR4基因表达抑制胰腺癌增殖和侵袭的体外研究

目的 利用RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,观察CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 在不同分化程度胰腺癌细胞株中筛选出CXCR4高表达胰腺癌细胞株,RNAi技术构建CXCR4shRNA表达载体,转染胰腺癌CXCR4高表达细胞Miapaca-2并应用G418筛选出稳定表达株,Real-time PCR、Western blot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;MTT实验检测CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖,应用Transwell侵袭小室观察CXCR4干扰对胰腺癌细胞侵袭转移力的影响.结果 胰腺癌细胞株Miapaca-2 CXCR4表达异常增高,特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70％以上.特异性CXCR4 shRNA能够抑制细胞生长,细胞达到对数生长期的时间延长(P＜0.05).Transwell实验证明CXCR4基因干扰后细胞侵袭能力减低(P＜0.05),即使SDF-1的刺激也不能够使细胞侵袭能力增加.结论 成功构建了针对胰腺癌细胞CXCR4的siRNA载体;CXCR4基因沉默能抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和成瘤能力.     

5，7-二甲氧基黄酮下调FoxMl基因表达对胰腺癌细胞上皮-间充质转化的影响

目的：探讨5,7二甲氧基黄酮（5,7-DMF）对胰腺癌细胞上皮-间充质转化的影响及分子机制。方法：用不同浓度DMF处理人胰腺癌Panc-1细胞,利用划痕法检测5,7-DMF干预后Panc-1细胞侵袭转移能力变化;用Western blot检测5,7-DMF干预后FoxM1蛋白表达情况;FoxM1siRNA转染人胰腺癌Panc-1细胞后,用Western blot进而检测 EMT相关上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子N-cadherin蛋白水平的表达变化。结果：5,7-DMF以浓度依赖方式显著抑制Panc-1细胞侵袭转移能力。5,7-DMF干预胰腺癌细胞后显著下调FoxM1表达水平;FoxM1 siRNA转染胰腺癌细胞,EMT相关分子E-cadherin表达升高,而N-cadherin表达降低,且与对照组相比均有统计学意义。结论：5,7二甲氧基黄酮可逆转胰腺癌细胞上皮-间充质转化,可能通过下调FoxM1水平是其重要机制之一,但其内在的分子机制尚需进一步探讨。     

岩藻糖基转移酶II对前列腺癌细胞生物学功能的影响及机制

目的：探讨岩藻糖基转移酶II（FUT2）对前列腺癌细胞生物学功能的影响及其潜在机制。方法：通过免疫组化技术检测FUT2 在前列腺癌组织中的表达情况。利用脂质体转染技术构建低表达FUT2的前列腺癌细胞株及其对照细胞株,并通过MTT实验、平板克隆实验、Transwell实验检测干扰FUT2表达对前列腺癌细胞生物学功能的影响。采用Western blot检测β-catenin、Cyclin D1和ICAM-1等蛋白表达水平。结果：FUT2在前列腺癌组织中的表达水平明显升高（P ＜0.05）。干扰FUT2的表达后,前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降,Cyclin D1表达下调,ICAM-1表达上调（P ＜0.05）。结论：FUT2促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

靶向survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 采用RNA干扰技术（siRNA）阻断survivin基因的表达，观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。方法 构建靶向survivin的siRNA质粒表达载体，采用Lipofectamine^TM2000转染胰腺癌细胞PC-2，采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞survivin基因表达的变化；采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用：采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞survivin基因表达，在mRNA水平其表达抑制率为81．25％，在蛋白质水平其表达抑制率为74．24％。转染靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种24、48h后其增殖抑制率分别为28．00％和33.38％：转染后24、48h可以诱导8．46％、7．53％的细胞凋亡。结论 所构建的靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞survivin基因表达。阻断survivin基因表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡，靶向survivin的siRNA在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

沉默液泡型ATP酶c亚基ATP6V0C抑制人前列腺癌细胞侵袭的分子机制

目的： 采用RNA干涉技术沉默液泡型ATP酶c亚基ATP6V0C的表达,探索ATP6V0C在前列腺癌侵袭中的分子作用机制,并研究其与LASS2/TMSG1的关系。方法与结果： ATP6V0C在高转移潜能人前列腺癌细胞系（PC-3M-1E8和PC-3M）中的表达明显高于低转移潜能人前列腺癌细胞系（PC-3M-2B4和PC-3）, 选择ATP6V0C表达量最高的PC-3M-1E8细胞进行基因沉默实验,发现ATP6V0C的siRNA转染PC-3M-1E8后,其基质金属蛋白酶2（matrix metalloprotein-2,MMP-2）和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达量及MMP-2的分泌量均无明显变化,但上清液中MMP-9的活性明显减弱,与空白对照组及阴性对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05);干扰组细胞外氢离子浓度及液泡型ATPase的活性明显降低（P<0.05);细胞划痕修复实验及transwell体外侵袭实验结果显示ATP6V0C siRNA干扰组细胞的体外迁移及侵袭能力明显减弱（P<0.05)。PC-3M-1E8细胞转染ATP6V0C siRNA后,LASS2/TMSG1的表达明显减弱（P<0.05)。免疫荧光双重染色结果显示ATP6V0C蛋白与LASS2/TMSG1共定位于胞浆和胞膜,干扰组共定位信号与对照组相比明显减弱。结论： 特异性siRNA沉默ATP6V0C能抑制人前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制与ATP6V0C沉默后抑制V-ATPase的活性,使细胞外氢离子浓度降低,抑制MMP-9的激活,从而影响细胞外基质的降解和重塑有关。靶向siRNA干扰ATP6V0C的表达后,可能通过反馈调节机制抑制LASS2/TMSG1的表达,但其具体分子机制尚待进一步研究。     

siRNA特异性沉默ADP核糖基化因子6对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的研究ADP核糖基化因子6（Arf6）对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响并初步探讨 其可能的分子作用机制。方法设计合成3条针对不同靶向区域的Arf6特异性siRNA序列,转染细胞后通过real-time PCR和 蛋白质印迹法检测其对Arf6的干扰效果,筛选出干扰效果最佳的siRNA序列;通过噻唑盐（MTT）实验、划痕实验、及transwell 细胞迁移和侵袭实验观察siRNA干扰Arf6表达对PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响;蛋白质印迹法检测AKT、p-AKT、ERK1/ 2、p-ERK1/2和Rac1蛋白表达水平的变化。结果与空白对照组相比,转染阴性对照序列对PC-3细胞内源性Arf6的mRNA和 蛋白表达水平无明显影响,3 条siRNA 序列均能抑制Arf6 的表达,其中siRNA-3 对PC-3 细胞Arf6 表达干扰效果最好,Arf6 mRNA和蛋白抑制率分别为（91.88±3.13）%和（86.37±0.57）%。siRNA-3干扰Arf6表达抑制PC-3细胞的增殖,且PC-3细胞体外 迁移距离和侵袭细胞数较空白和阴性对照组明显减少（P<0.05）。蛋白质印迹法检测发现转染siRNA-3的PC-3细胞p-ERK1/2 和Rac1表达水平明显降低,而AKT、p-AKT和ERK1/2表达水平较对照组差异无统计学意义。结论siRNA干扰Arf6表达可显 著抑制PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其分子作用机制可能与p-ERK1/2和Rac1表达下调相关。