P19细胞向心肌细胞分化过程中FHL1基因的表达变化

目的:观察FHL1(Four and a half LIM domains protein 1)基因在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨FHL1基因与心肌细胞分化之间的关系.方法:P19细胞经1%二甲基亚砜(DMSO)诱导悬浮培养4天形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至14天,观察细胞跳动情况,用肌钙蛋白I(cTnI)抗体行Western Blot以鉴定心肌细胞分化,并采用RT-PCR、Western Blot技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中 FHL1 基因mRNA和蛋白的表达水平.结果:DMSO 诱导4天后,用生长培养基黏附培养至第8天,P19细胞出现自发性节律跳动的细胞团片,Western Blot检测cTnI蛋白呈阳性.FHL1基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,Western Blot检测结果与RT-PCR检测结果基本一致.FHL1基因在分化第0～8天表达显著增高,各时间点之间差异显著(P<0.05);第8～14天表达趋于稳定,各时间点之间差异无显著性(P>0.05).结论:FHL1基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能参与心肌细胞的分化和发育.     

P19细胞向心肌细胞分化过程中ZNF207基因的表达变化

目的:观察锌指蛋白207基因(ZNF207)在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨ZNF207基因与心肌细胞分化之间可能的关系.方法:体外培养P19细胞,应用0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导其向心肌细胞分化,采用RT-PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中ZNF207基因mRNA表达水平.结果:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化的过程中均有表达,随细胞分化成熟.该基因表达水平逐渐升高.经统计学分析发现,在分化第0～2天该基因表达无差异;第2～10天表达持续性增高,各时间点之间均有差异,差异均有统计学意义(P＜0.05);第10～17天该基因稳定高表达,各时间点之间无差异.结论:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能有利于心肌细胞的分化和发育.     

eIF3 P170对发育心肌细胞周期的调控及其机制

目的：探讨eIF3 P170,cdc2,cyclinD1,cyclinB1在小鼠发育心肌细胞细胞周期中的表达及eIF3 P170与cdc2, cyclinD1,cyclinB1之间的相关关系。方法：取不同时间点小鼠心肌细胞,RT-PCR检测eIF3 P170,cdc2,cyclinD1和cyclinB1 mRNA的表达。结果：eIF3 P170,cdc2,cyclinD1和cyclinB1 mRNA的表达在胚胎第13,15,18天（G13,G15, G18）及小鼠出生后第1,2,3,5天（P1,P2,P3,P5）的表达均较强,在小鼠出生后第5天表达达到最强（P5与其他各时间点比较,P〈0.05）,而后表达逐渐减弱,在出生后第30天（P30）的表达降至最弱（P30与其他各时间点比较, P〈0.05）。eIF3 P170与cdc2,cyclinD1和cyclinB1 mRNA表达之间具有正相关关系。结论：eIF3 P170,cdc2,cyclinD1和cyclinB1 mRNA的表达在胚胎期及出生早期均较强,在小鼠出生后第5天达到最强,之后逐渐下降。     

p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化前后的变化

目的：探讨P19细胞向心肌细胞分化前后p22-phox水平的变化。方法贴壁培养P19细胞,取合适细胞株,应用0．9%二甲基亚砜( DMSO)诱导培养,收集诱导不同时间的细胞,通过Western blot检测其肌钙蛋白I( cTnI)水平,以确定分化,并行Western blot检测P19细胞向心肌细胞分化前后细胞中 p22-phox 蛋白水平。结果① P19细胞经0．9% DMSO诱导分化后,于第8天开始检测到cTnI表达阳性,后cTnI 表达增加,差异有统计学意义( P <0．05)。②P19细胞向心肌细胞分化后细胞内p22-phox水平较分化前高,差异有统计学意义( P<0．05)。结论 p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化后表达增加,氧化应激水平增高。     

FCCP对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的:探讨羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone,FCCP)对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响?方法:在P19细胞向心肌细胞诱导分化的过程中加入5 umol/L的FCCP,同时设立阴性对照组,显微镜观察分化过程中不同时间点P19细胞形态的变化,并采用 real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测GATA4?NKX2.5及cTnT在分化过程中的mRNA和蛋白表达水平?结果:FCCP处理组P19细胞形成的胚胎样小体较对照组体积小,结构较松散,形态不均一?在整个分化过程中,FCCP处理组GATA4 ?NKX2.5及cTnT基因均有表达,但整个动态表达过程较对照组延迟;Western blot结果显示,FCCP处理组GATA4?NKX2.5蛋白在第5?7?9天的表达量均较对照组低;在第11天,两组间GATA4蛋白的表达量差异无统计学意义;而NKX2.5在FCCP处理组的表达量仍低于对照组?FCCP处理组和对照组cTnT蛋白在分化第5?7天的表达量差异无统计学意义,而在第9?11天cTnT蛋白表达量FCCP组均较对照组低?结论:FCCP可抑制P19细胞向心肌细胞诱导分化的进程?     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?     

LRRC4通过MAPK信号通路阻滞U251细胞于G0/G1期

目的:探讨脑胶质瘤抑瘤基因LRRC4通过MAPK信号通路阻滞U251细胞于G0/G1的机制.方法:通过脂质体转染法将LRRC4基因转染至U251细胞,G418筛选构建稳定转染的LRRC4/U251细胞株并验证LRRC4的阳性表达;通过Western-blot检测LRRC4对MAPK信号通路的关键分子ERK,JNK及P38的表达影响;流式细胞仪、荧光素酶活性检测分析LRRC4对U251细胞周期及细胞周期素(cyclin D1)的影响.结果:LRRC4能够下调磷酸化ERK的表达,上调总蛋白JNK2和磷酸化c-Jun的表达.LRRC4下调了U251细胞中突变型P53的表达,以及cyclin D1的启动子活性和它的表达.LRRC4的重表达将U251细胞阻滞于G0/G1期.结论:LRRC4主要通过MAPK通路的关键分子JNK2上调磷酸化的c-Jun,抑制突变型的P53的表达,进而下调cyclin D1的启动子活性和cyclin D1的表达,将U251细胞阻滞于G0/G1期.     

外源性IL-18基因对C6胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究IL-18基因转染对C6胶质瘤细胞增殖活性及相关基因表达的影响. 方法:用流式细胞仪观察C6/IL-18细胞周期、增殖指数的变化;用RT-PCR,蛋白印迹、免疫细胞化学方法分析C6/IL-18细胞cyclin D1,cyclin B1,Bcl-2 mRNA及蛋白的表达. 结果:与亲代C6细胞相比,C6/IL-18细胞表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,细胞增殖指数(PI)降低. C6/IL-18细胞的cyclin D1和cyclin B1,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低. 结论: 外源性IL-18基因可降低C6细胞的增殖活性,其机制可能与Bcl-2,cyclin B1和cyclin D1表达下调有关.     

原发性肝细胞癌中P16/CDKN2基因表达的研究

应用原位杂交技术检测了２８ 例原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）中Ｐ１６／ＣＤＫＮ２ 基因ｍ ＲＮＡ的表达, 并用免疫组织化学法检测了Ｐ１６ 蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶４ （ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ ４, ＣＤＫ４） 蛋白的表达。结果显示： ７例ＨＣＣ的Ｐ１６基因ｍ ＲＮＡ为阴性, １３ 例为异质性减弱, ８ 例为保留表达。ｍ ＲＮＡ阳性的ＨＣＣ中, 均可见到Ｐ１６ 蛋白表达。Ｐ１６／ＣＤＫＮ２ 基因表达与ＨＣＣ的分级、分化及转移无关。２８ 例ＨＣＣ中共有６ 例出现ＣＤＫ４ 蛋白阳性,这６ 例ＨＣＣ均有不同程度的Ｐ１６ 蛋白表达, 提示ＣＤＫ４ 蛋白表达可能是灭活Ｐ１６ 蛋白的又一途径。     

细胞周期蛋白D1基因表达在心肌肥大形成中的时相性变化

目的：观察心肌肥大形成过程中细胞周期蛋白Ｄ１（ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）基因表达的时相性变化,并探讨ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１在心肌肥大形成中的作用。方法：肛用腹主动脉缩窄法建立大鼠心肌肥大模型,设缩窄手术组及假手术对照组,观察两组大鼠手术后不同时间心脏左心室（含左心室游离与室间隔）质量与体质量比、左心室游离壁厚度及心肌细胞横径的变化,以确证模型的稳定建立;其后应用ＲＮＡ印迹法分析检测ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达     

叶黄素对人食管鳞癌细胞诱导分化效应与机制探讨

目的 探讨叶黄素对食管癌EC9706 细胞诱导分化的影响及其机制.方法 食管癌EC9706细胞采用开放式单层贴壁培养.实验设溶剂对照及叶黄素3个剂量组,采用MTT法及流式细胞术,对EC9706 细胞的增殖和细胞周期进行分析,HE染色对细胞的形态学进行观察,酸解DNA甲绿-派洛宁技术了解增殖与分化型细胞比例,免疫组化检测cyclin D1的表达.结果 与溶剂对照组比较,叶黄素(100 μg/mL和150 μg/mL)可明显抑制EC9706 细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期, 降低细胞增殖指数,细胞形态趋向良性分化,cyclin D1 表达水平降低.结论 叶黄素可通过抑制cyclin D1 表达而介导食管癌EC9706细胞增殖抑制和诱导成熟分化.     

Ezh2在全反式维甲酸诱导的P19神经细胞分化过程中的作用

目的 探讨组蛋白甲基转移酶Ezh2在P19神经细胞分化中的作用.方法 通过Western印迹检测全反式维甲酸 (RA)诱导TuJ1蛋白的表达;通过染色质免疫沉淀技术检测Ngn1基因启动子区Ezh2的结合与H3K27三甲基化的变化;通过实时定量RT-PCR检测RA诱导P19细胞分化后 Ezh 2 mRNA表达.结果 在RA诱导P19细胞中,Ezh2与H3K27me3在Ngn1启动子区的结合逐渐升高,并在诱导后第2天达到高峰,然后迅速降低,随后出现神经分化特异标志.结论 Ezh2在RA诱导的P19细胞早期产生一种抑制性的组蛋白修饰标志H3K27me3,通过避免Ngn1的过早表达,确保P19细胞的正常分化.     

慢病毒介导BC047440基因沉默逆转HepG2/ADM细胞化疗耐药性机制的探讨

目的利用siRNA方法沉默HepG2/ADM细胞系中BC047440基因,观察其受抑制后对细胞多药耐药性的影响及其分子机制。方法建立BC047440蛋白在HepG2/ADM细胞系siRNA干扰模型,采用Western blot检测BC047440蛋白的表达;实验分3组:BC047440-shRNA组、control-shRNA组和HepG2/ADM组。CCK-8法分析阿霉素对细胞生长抑制率的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布;Western blot检测BC047440沉默后NF-κB蛋白表达的变化;Real-time PCR检测Survivin、CCNL1基因mRNA水平的变化。结果成功建立BC047440蛋白siRNA干扰模型;NF-κB蛋白表达BC047440-shRNA组约为HepG2/ADM组67.69%,约为control-shRNA组67.39%;细胞毒性实验中24、48 h阿霉素对BC047440-shRNA组细胞毒性作用明显增强;流式细胞仪检测结果显示BC047440-shRNA组细胞凋亡明显增多,细胞周期分布多停留于G1/G0期,S期细胞明显减少。Real-time PCR检测BC047440-shRNA组Survivin基因mRNA表达约为con-trol-shRNA组37%,约为HepG2/ADM组42%;检测BC047440-shRNA组CCNL1基因mRNA表达约为control-shRNA组3.5倍,约为HepG2/ADM组2.4倍。结论沉默BC047440基因可通过NF-κB信号通路及其下游Survivin、CCNL1信号逆转HepG2/ADM细胞的多药耐药性,提示BC047440基因可能是形成肝癌多药耐药的重要分子之一。     

S100A7表达下调对胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移能力的影响

目的 研究S100A7表达下调对胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 将胃癌SGC-7901细胞分为3组:未转染组、对照siRNA组和S100A7 siRNA组,后两组分别转染对照siRNA和S100A7 siRNA.利用实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹分析检测各组胃癌SGC-7901细胞中S100A7 mRNA和蛋白的表达;采用CCK-8和Boyden小室分别检测各组细胞增殖和细胞迁移能力的变化.最后采用蛋白质印迹分析法检测3组胃癌细胞中cyclin D1、Cdk2和MMP-2蛋白的表达.结果 S100A7 siRNA能下调胃癌SGC-7901细胞中S100A7 mRNA和蛋白的表达.S100A7 mRNA和蛋白表达下调抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖和迁移,并降低cyclin D1、Cdk2和MMP-2蛋白的表达.结论 S100A7表达下调介导的胃癌细胞增殖抑制和迁移降低可能与cyclin D1、Cdk2和MMP-2表达的下调密切相关.     

决奈达隆对新生大鼠心室肌细胞HCN通道mRNA和蛋白表达的影响

目的 通过检测新生大鼠心室肌细胞在给予药物决奈达隆前后超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN通道)mRNA和蛋白水平的变化,探讨决奈达隆对HCN通道表达的影响.方法 分离新生SD大鼠心室肌,Ⅱ型胶原酶消化,通过差速贴壁分离法收集获得单一的心室肌细胞.并根据浓度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L的决奈达隆对细胞进行处理48h)和时间(浓度为10 μmol/L的决奈达隆对细胞进行1、6、12、24、48 h的处理)梯度分组.采用实时荧光定量PCR法和Western blot检测HCN2、HCN4通道mRNA水平和蛋白水平.结果 浓度梯度组和时间梯度组的HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表达水平均低于对照组(P＜0.05);与对照组比较,10 μmol/L决奈达隆处理后12 h组的蛋白水平明显下调(P＜0.01).结论 决奈达隆可抑制HCN2、HCN4通道mRNA和蛋白的表达,且作用呈浓度依赖性,在给药后12 h达到最大作用.     

ARHI在胰腺癌组织中mRNA水平及蛋白表达

目的 研究胰腺癌组织中ARHI的mRNA水平与蛋白表达情况。方法 用单克隆抗体免疫组化及地高辛标记cDNA探针原位杂交的方法,对57例胰腺癌手术切除组织进行ARHI蛋白及mRNA检测,并以正常胰腺组织作对照。结果 ARHI在正常胰腺组织中的免疫组化及原位杂交阳性率分别为84.2%及82.5%;在胰腺癌中两者阳性率为52.6%,阳性率显著下降（P＜0.01）;ARHI的mRNA与蛋白表达有较好的一致性;此外,在纤维母细胞、平滑肌细胞、血管壁及肠粘膜上皮均可见阳性着色;ARHI的阳性率与癌分化程度及临床分期无关。结论 ARHI在胰腺癌中呈下调性表达,可能是一个抑癌基因;ARHI广泛存在于腺上皮及纤维、平滑肌等细胞中。     

细胞周期蛋白A2在大鼠急性心肌梗死后心肌细胞的表达

目的:探讨急性心肌梗死后梗死区周围心肌细胞内细胞周期蛋白A2(cyclin A2)的表达?方法:制作SD大鼠急性心肌梗死模型,分别于梗死后3d?1周?2周?3周?4周各处死5只大鼠,5只假手术大鼠为对照,取出心脏组织,进行Masson染色,同时使用免疫组织化学法检测心脏组织中cyclin A2及磷酸化组蛋白H3(phospho-histone H3,H3P)的表达?结果:Masson染色从病理上证明心肌梗死模型构建成功;梗死区周围心肌细胞cyclin A2的表达在梗死后1周时最高,阳性细胞染色百分比为(7.72 ± 1.16)%,2周后逐渐下降,梗死后4周时,与假手术组相似,几乎无阳性表达?梗死后第3天?1周?2周和3周均可见少量心肌细胞核表达H3P,其阳性率为1.56%~3.12%?结论:心肌细胞cyclin A2的阳性表达提示急性心肌梗死后梗死区周围少部分心肌细胞能重新进入有丝分裂周期?     

miR-125b和血管内皮生长因子A在肝细胞癌中的表达及两者的相关性

目的:探讨miR-125b与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况及与两者的相关性?方法:利用real-time PCR检测肝癌?癌旁组织?肝癌细胞Huh-7?HepG2以及正常肝细胞L02中miR-125b表达,应用real-time PCR和Western blot分别检测肝癌?癌旁组织中VEGF-A mRNA和蛋白表达?转染miR-125b模拟物(mimic)上调肝癌细胞HepG2中miR-125b表达后,real-time PCR和Western blot检测HepG2细胞中VEGF-A mRNA和蛋白表达?结果:miR-125b 在人肝癌组织中的表达较癌旁组织明显降低(P < 0.05);在肝癌细胞Huh-7?HepG2中的表达较L02明显降低(P < 0.05)?VEGF-A mRNA和蛋白在人肝癌组织中的表达较癌旁组织明显升高(P < 0.05)?miR-125b mimic上调HepG2中miR-125b表达后,转染组VEGF-A mRNA和蛋白表达较空白组和阴性对照组均明显下降(P < 0.05)?结论:miR-125b在肝癌中表达明显下调,而VEGF-A表达上调;低表达的miR-125b丧失对VEGF-A表达的抑制作用可能是肝癌发生的重要机制?     

补肾健脾方药对老年大鼠肝脏衰老有关基因表达的影响

目的：比较补肾、健脾方药对老年大鼠肝脏衰老有关基因表达的调控作用。方法：以自然衰老大鼠为衰老模型,随机分为老年对照组、老年补肾组、老年健脾组,并设青年大鼠对照组。予药物干预4个月后,采用RT-PCR和Western blot方法检测大鼠肝脏抑癌基因p16、抑癌基因p21、细胞周期素D1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期素E（CyclinE） mRNA转录和蛋白的表达。结果：老年大鼠肝脏p16、p21和Cyclin D1 mRNA/蛋白的表达明显增高,而PCNA和Cyclin E mRNA/蛋白的表达明显降低。补肾方药可明显下调肝脏p16和Cyclin D1,上调PCNA和Cyclin E基因mRNA与蛋白的表达;健脾方药能明显下调肝脏Cyclin D1,上调PCNA和Cyclin E基因mRNA与蛋白表达,但对p16作用不明显。结论：补肾、健脾方药均能不同程度调控肝脏衰老有关基因表达,促进老年大鼠肝细胞增殖,但补肾方药作用似更明显。