应用简单序列重复区间扩增多态性分子标记鉴定我国12个城市与地区常见嗜尸蝇类的研究

目的 探讨应用ISSR分子标记鉴定我国不同地区常见嗜尸蝇类,分析其亲源关系及基因差异.方法 采集广州、深圳、阳江、南京、长春、宜昌、北京、武汉等12个城市与地区常见嗜尸蝇类:家蝇(Musca domestica),丝光绿蝇(Luciliase ricata),大头金蝇(Chrysomyia megocephala),黑尾麻蝇(Helicophagella melanura),棕尾别麻蝇(Boetthcherisca peregrina).设计22个ISSR引物,对采集的蝇类基因组DNA进行PCR扩增,从中筛选出8个引物用于我国不同地区法医蝇类的鉴定.进行ISSR分析,用PAUP聚类分析软件绘制聚类图.结果 8种ISSR引物鉴定我国部分城市与地区5种蝇类,总共扩增样品次数为121,可放大679个清晰和稳定的带,其中516个是多态性.结果 表明我国不同城市与地区的家蝇、大头金蝇、丝光绿蝇、棕尾麻蝇、黑尾麻蝇分别呈现不同带谱,不同地区的家蝇呈现种内与地域多态性的遗传带谱.而5种腐尸性蝇种间呈现完全不同的带谱,发现种特异性的片段.聚类分析结果 显示:10个不同地区的家蝇聚类为一棵分枝树,细分为4个不同层次的类群,不同地区的大头金蝇、丝光绿蝇的绝大多数种类聚类在一起,亦存在种内基因型与地理株的基因组DNA差异.结论 应用ISSR技术,首次对我国12个城市和地区的常见嗜尸蝇类做出鉴定,揭示我国10个城市与地区的家蝇种类存在种内基因型和遗传的差异;不同地区的大头金蝇、丝光绿蝇亦存在种内基因型与地理株基因组DNA的差异.     

应用COⅠ短序列片段鉴定常见嗜尸性麻蝇

目的:利用线粒体DNA(mtDNA)中278 bp的细胞色素氧化酶辅酶Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ,CO Ⅰ)序列鉴定我国常见嗜尸性麻蝇,寻求快速、准确的嗜尸性麻蝇种类鉴定方法.方法:从12个省16个地区户外草地家兔尸体上采集麻蝇科3属4种共计19个样本.利用十二烷基硫酸钠-蛋白酶K法提取蝇类胸肌mtDNA; Eppendorf 5331型扩增仪对278 bp的CO Ⅰ基因片段进行PCR扩增;检测扩增产物,PCR胶回收纯化,测序并上传GenBank;利用MEGA4.0软件按邻近法构建无根系统发育树,通过序列分析建立种内及种间进化分歧表.结果:邻近法构建的发育树中4种麻蝇各自聚群,与形态学鉴定结果一致,上述麻蝇按照不同属、种分别聚类,其种内分歧整体均数均小于或等于3％,种间进化分歧均数在8％～12％之间.结论:COⅠ中278 bp基因序列能有效地鉴定常见嗜尸性麻蝇种类,进一步完善我国嗜尸性麻蝇基因库,为今后在实际案例中应用分子标记鉴定嗜尸性麻蝇进而推断死亡时间奠定基础.     

贵阳地区常见嗜尸性蝇类丽蝇科DNA条形码的构建

目的:构建贵阳地区常见嗜尸性蝇类丽蝇科的系统发育树。方法:对家兔尸体上采集到的嗜尸性蝇类丽蝇科的卵、幼虫及成虫提取DNA,扩增COI基因条形码区的序列,采用CLC Sequence View、MEGA软件进行序列分析,构建系统发育树。结果:共采集到丽蝇科5属9种嗜尸性蝇类,经序列测定确定各样本的形态学鉴定与分子鉴定是符合的,并以此序列构建出贵阳地区常见嗜尸性蝇类丽蝇科的系统发育树。结论:可以利用COⅠ基因条形码区序列构建的系统发育树进行贵阳地区嗜尸性蝇类的种属鉴定。     

内江市2011年蝇类监测分析

目的掌握我市城区各种蝇类构成、季节消长规律及蝇类引起传染病发生的关系、综合治理、科学防制,为创建国家卫生城市提供提供依据。方法笼诱法。结果大头金蝇(Chrysomya pinguis)、丝光绿蝇(Lucilia sericata)、棕尾别麻蝇(Boettcherisca peregrine)和巨尾阿丽蝇(Aldrichina grahami)为优势种群,3月入笼,8、9、10月达高峰,11月份基本无蝇。结论经城区统一灭蝇后,蝇密度下降,控制在国家要求范围内。     

中国14省不同地区常见嗜尸性苍蝇 mtDNA中 COⅠ基因序列检测

目的：通过检测嗜尸性苍蝇线粒体DNA(mtDNA)上细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ（COⅠ)中278 bp基因序列,鉴定嗜尸性苍蝇种类,为法医鉴别嗜尸性苍蝇种类提供可靠依据。方法：随机采集内蒙古包头、赤峰、天津、南宁、福州、山东临沂、石家庄、银川、兰州、北京怀柔、河南新乡及南阳、山西大同、安徽芜湖、浙江衢州、湖南长沙及株洲、永州等14个省不同地区室外多点放置兔、狗、猪尸体上的嗜尸性苍蝇38只。利用改进的小型昆虫DNA匀浆方法提取上述苍蝇mtDNA,进行PCR扩增;7%聚丙烯酰胺非变性凝胶连续缓冲体系垂直电泳和银染显色技术进行扩增结果检测;PCR胶回收试剂盒纯化;ABI3730测序仪测序;MEGA4软件包进行序列分析和构建UPGMA系统发育树。结果：有效鉴定出上述38只嗜尸性苍蝇,3科（蝇科、丽蝇科、麻蝇科）,10属（家蝇属、齿股蝇属、阿丽蝇属、带绿蝇属、裸金蝇属、原伏蝇属、金蝇属、绿蝇属、黑麻蝇属、别麻蝇属）,12种（家蝇、开普齿股蝇、叉叶绿蝇、亮绿蝇、巨尾阿丽蝇、瘦叶带绿蝇、白头裸金蝇、新陆原伏蝇、大头金蝇、丝光绿蝇、黑尾黑麻蝇、棕尾别麻蝇）。结论：mtDNA上COⅠ中278 bp基因序列分析能有效地对嗜尸性苍蝇进行种类鉴定。该检测方法快速、简便和精确,可以作为法医鉴别嗜尸性苍蝇种类的依据。     

中国7市家蝇rDNA-ITS2基因分析

目的:分析我国7市家蝇的rDNA-ITS2基因.方法:采集北京、吉林、长春、成都、南京、湖北荆州和养殖7市8个家蝇样本,形态鉴定. 依据Drosophila melanogaster的nrRNA序列,设计扩增不同地区家蝇rDNA-ITS2基因的引物,PCR扩增不同地区家蝇基因组,获特定基因片段,SSCP分析. 将PCR扩增不同地区家蝇rDNA-ITS2片段克隆于pMD-18T载体,序列测定,采用Clustal W软件在线分析不同地区家蝇rDNA-ITS2序列,用MegAlign(4.0)软件的UPMGA方法构建系统发育树. 结果:我国7市8个家蝇样品的rDNA-ITS2基因均获约360 bp阳性扩增区带. SSCP分析8个家蝇样品的rDNA-ITS2的SSCP电泳DNA迁移率均有一定差异. Clustal W比对分析不同地区的8个家蝇rDNA-ITS2基因序列间存在一定差异. 同源性为75%,而其中部分地区家蝇样品rDNA-ITS2序列同源性高,家蝇(长春、吉林、养殖),三者之间的同源性为98.0%～99.1%;家蝇(成都、南京、广州、荆州)之间的同源性为99.1%～99.7%. 系统聚类分析显示,发育树共分成2支,1支是家蝇(北京与养殖)关系密切,先聚为一类,然后与家蝇(长春)再聚类;另1支是家蝇(成都与荆州)关系密切,最先聚类,然后与家蝇(南京)聚类,再与家蝇(广州)聚类,最后与家蝇(吉林)聚类. 结论:应用PCR-SSCP和rDNA-ITS2基因序列分析揭示我国不同地区家蝇基因组序列存在一定差异.     

我国几种常见麻蝇三令幼虫的形态研究

关于各种麻蝇幼虫形态分类的研究,过去在国内外文献中都记载得不多,例如Pattons氏(1929)、James氏(1947)等的描述都很零星片断。Зимин氏(1948)在苏联塔吉斯坦所作的研究相当深入,其中包括了在我国也很常见的黑尾麻蝇Sarcophaga(B.)melanura Mg.、红尾麻蝇S.(C.)haemorr-hoidalis Fallen及红尾拉蝇Ravinia striataFab.。Kano氏(1951)在日本对当地几种麻蝇幼虫的头咽骨和前后气门作了形态观察,     

浙江上虞常见蝇类调查

(一)常见蝇类总的季节消长高峰在8—9月份;大头金蝇和舍蝇的高峰在7—10月份,特别是9月份数量最多;绿蝇和麻蝇全年有两个小高峰,前一个在6—7月份, 后一个在9月份;巨尾阿丽蝇是全年5月份显出高峰的最早出现的蝇种,它在气温最高的7—9月消失。 (二)五个不同场所常见蝇类以大头金蝇占第一位,舍蝇占第二位,绿蝇占第三位。棕尾别麻蝇是21种麻蝇中经常发现及数量最多的优势种,其它常见的还有尾黑黑麻蝇和黄须亚麻蝇等。     

多聚酶链反应-单链构象多态性分析基因点突变

单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)是一种简便、敏感有效的鉴定扩增DNA序列变化的技术.相同长度的单链DNA因其序列不同(甚至单个碱基不同),形成的构象相异,电泳时泳动速度不一.PCR产物经变性后进行单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳时,靶DNA中若有单个碱基替换等改变时,会出现泳动变位(mobility shift).PCR-SSCP的最主要优点是简单,在不同的系统中突变检出率达70%～95%以上,其主要不足可能是漏检一些突变.作者根据本实验室对多抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)p53突变的检测,介绍PCR-SSCP的实验过程.     

蝇类的研究 (1)吉林省东北部地区蝇类调查报告

1.作者自1959～1964年间,断续地在吉林省东北部地区作了蝇类的调查,共得6科26属45种。2.将捕集的蝇类,以种、属、科的组成及其比率来看,丽蝇科(49.16%)居首位,蝇利(21.03%),麻蝇科(14.32%)次之。绿蝇属(26.82%)居首位,伏蝇属(14.22%),黑蝇属(10.46%)次之。亮绿蝇(17.52%)居首位,伏蝇(14.22%)次之,上述这些科、属、种占本地区的优势地位。其中较常见的种类有亮绿蝇、丝光灿蝇、伏蝇、新陆原伏蝇、厚环黑蝇、尾黑麻蝇、舍蝇等7种,它们占整个蝇群的2/3。 3.文中对较为重要的蝇属栖息场所及出现季节作了简述。4.文中对家蝇属在我国已发现几个亚属作了温习外,对家蝇亚属的两个亚种的地理分布以及 Muscadomestica domestica在我国东北北部,内蒙北部地区分布如何,进行了较详尽的讨论,并推论认为,如经详细调查研究,不仅能在旧北区,西伯利亚亚区,达夫利亚分区(即东北亚区的兴岭区发现),而且还有可能在西伯利亚区长白山分区的北部,即乌苏里江流域,黑龙江下游的一些地区,有可能发现本亚种的分布。     

日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的rDNA-ITS2遗传多态性研究

目的 分析日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因的遗传变异.方法 采集2种吸虫成虫标本,提取其基凶组DNA,PCR特异性扩增rDNA-ITS2基因并测序;Clusterx软件进行多序列对比;MEGA 4软件计算遗传距离,NJ法和MP法构建系统进化树;DNAsis软件对rDNA-ITS2序列片段进行模序分析.结果 2种方法构建的遗传系统进化树基本结构相似,日本血吸虫与斯氏并殖吸虫间存在较远的遗传距离,但二吸虫ITS2序列间有42.7%的相似性.利用DNAsis软件在日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的rDNA-ITS2序列中发现AP_2_CS6、bHLH_CS和CAP_site 3种相同的转录因子.结论 日本血吸虫和斯氏并殖吸虫虽然在rDNA-ITS2基因水平上存在明显种间差异,但在rDNA-ITS2序列、转录因子方面具有重要的相似性.     

云南洱海环湖带绦虫rDNA-ITS2序列测定及分析

目的：对云南洱海环湖地区的带绦虫标本的rDNA-ITS2区段序列进行测定,确定亚洲带绦虫在洱海环湖地区的分布情况,进一步探讨亚洲带绦虫的分类地位。方法：取大理挖色、洱源、喜洲、周城、双廊、贵州都匀、贵州从江和传统牛带绦虫成虫标本,分别提取DNA,PCR扩增rDNA-ITS2片段后做序列测定及分析,并构建系统进化树。结果：根据ITS2测序结果构建系统进化树显示,树共分为两大枝,洱源、挖色和从江标本为第1枝,周城、喜洲、双廊和都匀为第2枝。结论：洱源与挖色存在传统牛带绦虫,周城、喜洲和双廊存在亚洲带绦虫。传统牛带绦虫和亚洲带绦虫在大理地区有分布区域上的重叠性。     

苯丙氨酸羟化酶基因突变家系PCR-SSCP分析

目的探讨聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）检测方法对确定苯丙酮尿症（PKU）患者基因突变来源的应用价值,以便更好地应用于PKU基因诊断和产前诊断。方法对15例确诊的经典型PKU患者及其双亲的PAH基因的第3、5、6、7和11外显子及部分内含子行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析;无PKU家族史的正常人作为正常对照。PCR-SSCP检测出异常外显子行PCR正、反向测序确定突变类型并分析患者的基因突变来源。结果5例患者的30个等位基因共检出16个突变,共14个突变等位基因来源均得到确定,1例患者（基因型为G247V/R243X）的突变来源未能确定。结论（1）PCR-SSCP检测方法可以确定PKU患者的基因突变来源（包括纯合突变和杂合突变）,但对于2个基因突变位于同一外显子的杂合子患者,该方法不能很好地确定基因突变来源。（2）PCR-SSCP方法能够区分基因突变纯合子与基因突变杂合子。     

中国迟发型2型糖尿病患者葡萄糖激酶基因突变研究

目的 :探讨中国迟发型 2型糖尿病患者葡萄糖激酶 ( glucokinase ,GCK)基因的突变情况。方法 :收集了中国汉族 47个迟发型 2型糖尿病 (late onsetType 2diabetes)家系 ,应用多聚酶链反应 单链构像多态性 ( polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,PCR SSCP)的分析方法 ,对先证者GCK基因 12个外显子进行突变检测。结果 :6 ,9号外显子SSCP电泳时 ,出现异常电泳条带。测序证实在 6号内含子 38bp处发生C→T的单个碱基改变 ,变异基因频率为 35 .1%;9号内含子 8bp处发生C→T的单个碱基改变 ,变异基因频率为5 7.5 %。结论 :发现了中国人两个单核苷酸多态位点 :IVS6%D 38C→T ;IVS9%D 8C→T。GCK基因突变不是中国汉族迟发型 2型糖尿病的主要致病原因。     

巴戟天与常见混伪品的rDNA-ITS序列分析及其分子鉴定

目的比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNA-ITS碱基序列的差异及其规律,同时为巴戟天及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记。方法对巴戟天及其常见混伪品的rDNA-ITS进行了PCR扩增、测序,并运用CLUSTALX、MEGA软件对该区进行序列分析。结果测定了巴戟天及其混伪品的rDNA-ITS区序列,包括ITS1、5.8S和ITS2全长序列以及18S、26S部分序列。巴戟天与假巴戟天、羊角藤在ITS1和ITS2区的差异性分别为2.9%~5.8%和2.9%~4.2%,而与虎刺在ITS1和ITS2区的差异性则为21.2%和18.9%。根据ITS序列特征构建的系统树,混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类,然后与巴戟天聚在一起,而虎刺则单独聚为一支。结论rDNA-ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。     

PCR-SSCP法检测人类补体第八成分C8A DNA多态性研究

目的建立一种检测人类补体C8ADNA多态性的新方法。方法C8A多态性的分子基础是C8A基因在第三外显子碱基发生了C→A的突变，通过特异性扩增C8A基因第三外显子，采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR—SSCP）方法结合DNA序列分析检测成都地区98份无血缘关系样本DNAC8A基因型．结果共发现3种基因型，CSA＊AA、CSA＊BB和CSA＊AB，观测到的基因型频率分布符合Hardy—Weinberg平街定律．结论PCR—SSCP检测CgA多态性快速、简便、可靠、成本低，适用于大样本的筛选，在群体遗传学及法医学实践中有较好的府用价信．     

Detecting katG Drug Resistant Genetic Mutation among pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis in Mycobacterium tuberculosis L-forms by PCR-SSCP

Objective：To study the relationship between mutation in the katG gene and drug resistance of INH in Mycobacterium tuberculosis L-forms among patients of pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis, and to explore the clinical application of PCR-SSCP. Methods： A total of 52 clinical isolated strains of Mycobacterium tuberculosis L-forms were collected. Mutation in the katG genes was detected by PCR-SSCP and traditional antimicrobial susceptibility test （AST）. Results： The results by AST showed that there were 40 persisters in 52 clinical isolated strains. The drug resistant rate was 76.92%（40/52）, and the gene mutation rate of katG was 57.70%（30/52）by PCR-SSCP, the difference was no quite significance （X^2 = 2.8507, P 〉 0.05）. The coincidence rate of two methods was 75.00% （30/40）. Conclusion： The detectionrate of katG resistant strains in Mycobacterium tuberculosis L-forms was high by PCR-SSCP. The combined application of PCR-SSCP and traditional antimicrobial susceptibility test can improve the detecting rate.     

云贵两省三地牛带绦虫核糖体rDNA-ITS1序列分析

目的: 采用PCR克隆测序方法,对采自贵州省都匀、从江及云南省大理三地牛带绦虫,与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种标本进行比较,为贵州都匀、从江及云南大理牛带绦虫标本鉴别提供分子生物学证据,并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种分类学地位.方法: 取贵州都匀株、贵州从江株、云南大理株和台湾桃园株成虫节片,抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS1区段,克隆测序;结合GenBank中已知猪带绦虫rDNA-ITS1序列,构建系统发育树.结果: 贵州都匀、云南大理牛带绦虫标本、台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的ITS1序列基本一致,同源性达98%～99%;贵州从江牛带绦虫标本ITS1序列与前三者有30个碱基差异,与台湾桃园、贵州都匀和云南大理同源性均为97%.系统发育树显示:贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本与台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的遗传距离最接近,距贵州从江牛带绦虫标本较远,与猪带绦虫则更远.结论: (1)贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本属于牛带绦虫亚洲亚种,贵州从江牛带绦虫标本属于传统牛带绦虫.(2)rDNA-ITS1序列分析可以用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学研究.     

应用PCR-SSCP方法检测肺癌、肠癌中p53基因突变

目的　研究ＰＣＲ－ ＳＳＣＰ 检测肺癌、肠癌中ｐ５３ 基因突变的方法改进及突变率。方法　用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ,银染技术检测４ 例肺癌和７ 例大肠癌组织标本中ｐ５３ 基因外显子５ ～８ 。结果　肺癌ｐ５３ 基因突变率为７５％ （３／４ 例）,肠癌ｐ５３ 基因突变率为４２．９％ （３／７ 例） 。结论　ｐ５３ 基因突变与肺癌、肠癌的发生密切相关,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术简便快速、灵敏安全的基因突变检测方法,可应用于肿瘤的临床基因诊断。