C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒作用机制的研究

目的 探讨C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用机制。方法 构建C基因截短的真核表达载体pcDNA3-△C及野生型C基因真核表达载体pcDNA3-C，瞬时转染HepG2细胞，用SDSPAGE western blot检测pcDNA3-△C、pcDNA3-C的蛋白表达。pcDNA3-△C与adwR9共转染HepG2细胞，以pcDNA3与adwR9为对照，用荧光定量PCR检测培养上清液及细胞内病毒量，用Native western blot分析C基因截短蛋白干扰核心颗粒形成。结果重组载体pcDNA3-△C、pcDNA3-C均可表达，DcDNA3-△C与adwR9共转染组上清液和细胞内病毒量较对照组降低，pcDNA3-△C和pcDNA3-C共转染组Native western blot条带与pcDNA3和pcDNA3-C共转染组条带相比较明显淡。结论 C基因截短突变体可干扰核心颗粒的形成，导致HBV复制下降。     

以乙型肝炎病毒为载体的基因治疗研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)作为肝靶向性基因治疗载体的可能性。方法 用外源报告基因绿色荧光蛋白(GFP)取代HBV S基因读码框构建重组HBV载体,通过脂质体转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察外源基因的表达,半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细胞核内HBV 共价闭合环状DNA构型,常规PCR和Southern杂交检测上清液重组病毒DNA。结累 携带外源基因GFP的重组HBV载体能够在肝细胞内表达外源蛋白,此重组载体为复制缺损型,单独转染后不能在肝细胞包装与复制,在缺失包装信号ε的辅助HBV质粒下可被包装成携带外源基因的成熟重组HBV颗粒并分泌到胞外。结论 HBV可被改造成肝靶向性基因治疗载体。     

药物治疗过程中乙型肝炎患者血清病毒外膜大蛋白与病毒核酸的检测分析

目的探讨阿德福韦酯(ADV)抗病毒治疗慢性乙型肝炎(CHB)过程中,患者血清中乙型肝炎病毒大蛋白(LHBs)和乙型肝炎病毒(HBV)DNA载量的相关性及临床意义,评价LHBs在ADV抗病毒治疗中的应用价值。方法将117例CHB患者分为HBeAg阳性组49例,HBeAg阴性组68例,分别给予ADV 10 mg,口服,每日1次,治疗96周。采用ELISA法检测LHBs和HBV免疫标志物(HBV-M);采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA。结果抗病毒治疗24、48、72、96周后HBV DNA和LHBs转阴率无明显差别(P>0.05),LHBs水平与HBV DNA拷贝数对数呈正相关(r=0.827);LHBs A值和HBV DNA拷贝数随抗病毒治疗时间的延长同步下降;在HBeAg阳性组46例中HBV DNA、LHBs转阳率分别为58.7%(27/46)、54.3%(25/46),两者差异无统计学意义(P>0.05);在HBeAg阴性组68例中HBV DNA、LHBs转阳率分别为48.5%(32/66)、65.2%(43/66),两者差异有统计学意义(P<0.01)。结论 LHBs是判断HBV体内复制的可靠指标,尤其对判断HBeAg阴性患者体内病毒复制及预后评价具有重要价值。     

阿德福韦酯联合复方鳖甲软肝片治疗乙型肝炎肝硬化的临床观察

目的观察阿德福韦酯联合复方鳖甲软肝片治疗乙型肝炎肝硬化失代偿期的疗效和安全性。方法 78例乙型肝炎肝硬化失代偿期患者随机分为阿德福韦酯与复方鳖甲软肝片联合治疗组及单用阿德福韦酯对照组,观察48周时两组患者肝功能、Child-Pugh分级及血清HBV DNA自基线下降的水平。结果治疗48周后,治疗组肝功能、Child-Pugh分级及血清HBV DNA自基线下降水平与治疗前比较差异均有统计学意义（P〈0.01）;联合治疗组肝纤维化指标及脾门厚度的下降值均优于对照组（P〈0.01）。结论阿德福韦酯联合复方鳖甲软肝片治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化明显优于单用阿德福韦酯。     

自体骨髓单个核细胞移植对肝硬化患者血清白蛋白的影响

目的探讨经肝动脉插管自体骨髓单个核细胞(BM-MNCs)移植对肝硬化患者血清白蛋白(ALB)的影响。方法 201例肝硬化患者中,131例进行自体骨髓单个核细胞移植,70例为对照。骨穿采集自体骨髓,分离纯化单个核细胞将其经肝动脉插管移植入肝脏。分别于移植后4、8、12及24周观察ALB变化情况,比较不同Child-Pugh分级肝硬化患者ALB的改变。结果移植组患者移植前血清ALB平均为(29.33±3.92)g/L,移植后第4、8、12、24周分别为(32.37±4.63)g/L、(32.82±4.84)g/L、(32.95±5.10)g/L和(32.22±5.87)g/L。移植后24周内血清ALB水平较移植前显著升高,而对照组则无明显变化,两组比较差异有统计学意义。移植组中,Child-PughA、B级患者血清ALB改善程度大于C级患者。移植后无严重不良事件发生。结论自体骨髓单个核细胞移植能提高肝硬化患者血清ALB水平,对Child-PughA、B级患者改善明显。     

乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应

为了解ＨＢＶＸ基因表达产物对ＨＬＡ ＤＲ表达的效应 ,构建带Ｘ基因的重组表达载体 ,研究其在体外肝癌细胞中的表达及其对ＨＬＡ ＤＲ表达的影响。用野生型ＨＢＶＸ基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒 ｐＷＨＸⅡ转染ＨｅｐＧ2细胞。用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等分析鉴定目的基因ＤＮＡ片段与其在转染细胞中的表达产物ＨＢＶＸ蛋白。将带重组质粒 ｐＷＨＸⅡ的ＨｅｐＧ2细胞和带有ＨＢＶ全基因组的 2 .2 .15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测 ,均清晰地显示在肝细…     

C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

抗一HCV阳性无病毒血症患者HCV特异性免疫反应研究

目的 研究抗ＨＣＶ阳性无病毒血症患者特异的体流及细胞免疫状态。方法 对１５例抗ＨＣＶ阳性无病毒血症患者,１５例慢性ＨＣＶ持续感染者及１５例正常对照者进行研究。通过ＭＴＴ、ＬＤＨ释放法、酶联免疫等方法观察患者外周Ｔ细胞反应、自然杀伤（ＮＫ）细胞活性、细胞因子分泌及特异性体液免疫反应。结果 无病毒血症者Ｔ细胞增殖反应明显大于持续感染者及对照组,并且Ｔ细胞对核心区抗原增殖最大,ＮＳ３次之,对ＮＳ５则无明     

慢性乙型肝炎外周血T淋巴细胞亚群变化及其临床意义

目的:比较慢性乙型肝炎(CHB)感染者外周血T细胞亚群的变化,探讨其与临床疾病状态的关系。方法:用流式细胞术(FCM)检测HBeAg阳性ALT异常者42例(A组);HBeAg阳性ALT持续正常者25例(B组);HBsAg阳性、HBeAg、HBV-DNA及ALT正常者20例(C组);健康体检(各型病毒学指标均为阴性)者25例外周血中T淋巴细胞亚群。结果:A、B组CD4+T细胞数量较C组及正常组明显降低;而CD8+T细胞数量较正常组明显升高(P0.01),CD4+/CD8+、CD4+CD25+T细胞与正常组比较明显降低(P0.05)。结论:慢性乙肝HBeAg阳性ALT正常患者Ts细胞数量增多,Th细胞和CTL细胞受到抑制,乙肝病毒复制与CD4+T细胞及CTL数量低下,抑制性T细胞增高高度相关。通过T淋巴细胞亚群的检测可以监控患者的免疫状态,从而为指导临床免疫治疗提供依据。     

骨髓单个核细胞移植对不同Child—Pugh分级肝硬化血清胆碱酯酶的影响

目的 探讨肝动脉插管自体骨髓单个核细胞移植对不同Child～Pugh分级肝硬化患者血清胆碱酯酶（CHE）的影响。方法201例肝硬化患者,其中131例行自体骨髓单个核细胞移植,70例为对照。骨髓穿刺采集自体骨髓,体外分离纯化骨髓单个核细胞,经肝动脉插管将其移植入肝脏。分别于移植后4、8、12、24周观察血清CHE变化情况,比较不同Child—Pugh分级肝硬化患者CHE改变,并观察患者并发症发生情况。结果移植组患者移植前血清CHE为2387．4U／L,移植后4周、8周、12周和24周分别升至2875．9U／L、3190．6U／L、3216．0U／L和3066．5U／L。患者移植后24周内血清CHE水平较移植前显著升高,而对照组无明显升高,两组比较差异有统计学意义。移植组中,Child—PughA级和B级患者血清CHE改善程度优于C级患者。两组患者24周内主要并发症发生率差异无统计学意义。移植后无严重不良事件发生。结论自体骨髓单个核细胞移植能提高肝硬化患者血清CHE水平,对Child—PughA级和B级患者改善明显。