神经干细胞移植治疗神经变性疾病的实验研究

目的:体外分离培养的胚胎大鼠神经干细胞(NSCs),移植入患有舞蹈症的转基因大鼠的纹状体内的存活、分化情况及对大鼠脑内多巴胺含量的影响.方法:无菌条件下剖腹取5只SD胚胎大鼠(孕15d)剥离出整个脑组织,进行体外神经干细胞的扩增培养,收集细胞悬液用自动微量注射器垂直刺入大鼠纹状体.结果:胚胎大鼠脑组织中分离的NSCs,可在体外稳定扩增,并且具有分化为神经元的能力,将标记的NSCs细胞悬液移植入大鼠纹状体,移植后5个月,免疫组化检测发现损伤的多巴胺神经元处显示酪氨酸羟化酶呈阳性的神经元.结论:在受损的纹状体移植入NSCs后,NSCs可被诱导分化为多巴胺神经元,进行功能重建.可见应用体外扩增的NSCs移植治疗神经性疾病是可行和有效的.     

神经干细胞移植治疗神经变性疾病的实验研究

目的:体外分离培养的胚胎大鼠神经干细胞(NSCs),移植入患有舞蹈症的转基因大鼠的纹状体内的存活、分化情况及对大鼠脑内多巴胺含量的影响。方法:无菌条件下剖腹取5只SD胚胎大鼠(孕15 d)剥离出整个脑组织,进行体外神经干细胞的扩增培养,收集细胞悬液用自动微量注射器垂直刺入大鼠纹状体。结果:胚胎大鼠脑组织中分离的NSCs,可在体外稳定扩增,并且具有分化为神经元的能力,将标记的NSCs细胞悬液移植入大鼠纹状体,移植后5个月,免疫组化检测发现损伤的多巴胺神经元处显示酪氨酸羟化酶呈阳性的神经元。结论:在受损的纹状体移植入NSCs后,NSCs可被诱导分化为多巴胺神经元,进行功能重建。可见应用体外扩增的NSCs移植治疗神经性疾病是可行和有效的。     

人神经干细胞临床移植治疗帕金森病

目的:探索人神经干细胞移植治疗帕金森病(Parkinson disease,PD)的有效方法.方法:5～11周人胚胎的前脑细胞在体外稳定扩增,并向多巴胺神经元转化,通过立体定向手术将其植入PD患者的纹状体;2000年11月至2002年11月,采用此方法治疗50例PD患者.结果:人胚胎前脑细胞可在体外扩增并维持不分化状态1年以上,扩增的细胞可达原始细胞数量的1×107倍,并可向多巴胺能神经元转化;PD患者临床移植手术后随访8～30个月(平均24个月),有效率为92％,未见明显的免疫排斥反应.结论:应用体外长期扩增的人类神经干细胞移植治疗PD是可行和有效的.     

胚胎神经上皮干细胞PD大鼠模型脑内移植的比较

目的观察胚胎神经上皮干细胞分别植入PD大鼠模型两侧纹状体内的存活、分化及对疾病的治疗情况。方法将GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖后,分别立体定向移植到PD模型鼠的毁损侧纹状体和健康侧纹状体内,术后观察动物的行为改变,分期取材后检测移植细胞的存活与分化状况,比较两种移植方式的治疗作用。结果移植后实验动物的旋转行为明显改善,移植细胞在宿主脑内存活良好,并分化出TH阳性神经元,损伤侧移植组效果更好。结论神经上皮干细胞植入损伤侧纹状体内的治疗效果更好。     

增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞移植对帕金森病大鼠模型的治疗作用

目的 探讨骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠的疗效及其在脑内存活、迁徙、分化规律.方法 将造模成功的PD大鼠随机分为两组,将增强型绿色荧光蛋白(en-hanced green fluorescent protein,EGFP)标记的MSCs及PBS分别移植入两组PD模型纹状体.术后每周进行旋转试验,第1周和第9周行脑神经元特异性核蛋白(Neun)、胶质细胞源性蛋白(GFAP)及酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化鉴定,第9周行Western blot检测两组模型纹状体内TH的表达.结果 移植前MSC组及PBS组旋转次数分别为(8.2±0.6)、(8.3±0.6)圈/min,差异无统计学意义(P>0.05);术后第3周分别为(7.5±0.5)、(8.1±0.6)圈/min,差异有统计学意义(P<0.05),并持续至术后第9周.移植后第1周MSCs主要分布于针道附近.第9周则迁徙至两侧大脑半球,以移植侧半球为主.最远迁徙至胼胝体的末端.小脑及脑于未见移植细胞.全脑未见畸胎瘤的形成.术后第1周免疫组化染色仅见GFAP和Neun表达.第9周GFAP、Neun仍有表达,以GFAP居多,同时在纹状体内还可见少量TH表达,提示MSCs在脑内主要分化为胶质细胞.部分为神经元.少数分化为多巴胺能神经元(dopaminergic neuron.DN).PBS组免疫组化染色未见上述蛋白的表达.Western blot检测仅MSCs组大鼠纹状体有TH的表达.结论 MSCs移植入纹状体后可分化为DN,从而改善PD症状,其移植治疗PD大鼠模型可能是安全有效的.     

帕金森病大鼠颈动脉体球细胞块移植治疗的实验观察

为评估颈动脉体球细胞块移植治疗帕金森病（PD）的疗效。采用立体定位注射6－羟多巴胺（6－OHDA）制备偏侧PD大鼠模型，右侧纹状体内分别移植入自、异体颈动脉体和胚鼠中脑组织块，移植后2、4、8和12周记录阿朴吗啡诱发大鼠的旋转行为，测定移植区谷氨酸（Glu)、甘氨酸（Gly)、天门冬氨酸（Asp)、γ-氨基丁酸（GABA）和多巴胺（DA)的含量变化。结果发现：与对照组比较，PD大鼠阿朴吗啡诱发的旋转行为明显改善达12周之久，DA水平升高显著（P＜0.01)且以自体颈动脉体移植组最佳；自体颈动脉体移植组纹状体内Glu和GABA含量显著降低（P＜0.01)。结果表明：脑内移植颈动脉体球细胞块可明显改善PD大鼠药物诱发的旋转行为，提高纹状体内DA含量并降低Glu和GABA含量，是一种有效治疗PD的方法。     

骨髓间充质干细胞黑质内移植对帕金森病大鼠的治疗作用

目的 探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植到帕金森病（PD）大鼠毁损侧黑质内，PD模型大鼠的姿势不对称性和黑质及纹状体内酪氨酸羟化酶（TH）表达的改变，以及BMSCs在大鼠脑内的存活、分化情况。方法 黑质、前脑内侧束两点法注射6-羟多巴胺（6-OHDH）并行为学分析筛选PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为移植组和对照组。BMSCs移植术后4周和8周，观察大鼠姿势不对称性，免疫组织化学及免疫荧光显色方法检测黑质和纹状体TH的表达变化以及BMSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。结果 BMSCs黑质内移植使可PD模型大鼠的转动频率由10.62?.97 r/min降至4.65?.08 r/min（P<0.01），显著增加毁损侧黑质TH阳性细胞数量和纹状体内TH阳性纤维密度。BMSCs在大鼠黑质内可以存活至少8周，部分细胞分化为神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结论 黑质内移植BMSCs对PD模型大鼠有一定的治疗作用。     

移植诱导中脑NSCs分化的多巴胺能神经元对PD大鼠治疗作用的实验研究

目的研究移植诱导中脑神经干细胞分化出的多巴胺能神经元对PD大鼠的治疗作用.方法利用纹状体提取液诱导大鼠胚胎中脑神经干细胞,使其部分分化为酪氨酸羟化酶(TH)阳性的多巴胺能神经元,继而把分化后的细胞移植到PD大鼠的纹状体内,免疫组化法证实移植细胞的存活并以诱发旋转行为的改善来观察其治疗作用.结果纹状体提取液能够诱导中脑神经干细胞分化出多巴胺能神经元而且这种经诱导后产生的细胞能够在PD大鼠体内长期存活并改善阿卟吗啡诱导的旋转行为.结论诱导中脑神经干细胞分化出的多巴胺能神经元对PD有一定的治疗作用.     

帕金森病模型大鼠纹状体肾上腺髓质移植后突触结构的观察

目的 :对移植到帕金森病模型大鼠纹状体内的嗜铬细胞与脑细胞之间形成的突触结构进行观察。方法 :实验用Wistar大鼠 4 0只 ,注射 6羟多巴胺 ( 6 -OHDA)破坏大鼠一侧黑质纹状体系统 ,制成实验性帕金森病 (PD)动物模型。将肾上腺髓质植入PD模型大鼠纹状体内 ,移植后定期检测大鼠阿朴吗啡诱发旋转行为 ,并用电镜观察嗜铬细胞与脑细胞之间形成的突触结构。结果 :移植组大鼠的阿朴吗啡诱发旋转行为明显改善 (P <0 0 5)。电镜观察发现嗜铬细胞与脑细胞之间形成突触结构 ,以嗜铬细胞为突触前膜的占 72 88% ;以嗜铬细胞为突触后膜的占 2 7 12 %。结论 :移植肾上腺髓质后 ,模型大鼠阿朴吗啡诱发旋转行为明显改善 ,嗜铬细胞与宿主脑细胞之间形成突触联系 ,并以嗜铬细胞为突触前膜的为多。     

GFP转基因鼠神经上皮干细胞纹状体内移植的实验研究

目的：观察GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞的体外培养及脑内移植后的存活与分化状况。 方法：将GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞置于无血清培养基内纯化扩增,用巢蛋白免疫组织化学染色鉴定神经干细胞,将扩增后的含GFP基因的神经干细胞在立体定位仪下,定向移植到大鼠的纹状体内。术后不同时期取材、切片,在荧光显微镜下观察移植细胞的存活状况,行微管相关蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色鉴定移植细胞的分化状况。结果： GFP转基因鼠神经管来源的神经上皮干细胞在无血清培养基内能增殖形成神经球,呈巢蛋白阳性。纹状体内移植2周、4周均可见明显的呈绿色荧光的移植细胞,显示细胞存活良好。免疫组织化学染色显示移植细胞在不同间隔时间可分化为MAP-2、GFAP及TH阳性细胞。结论： GFP转基因鼠来源的具有GFP标记的胚胎神经上皮干细胞可在体外培养扩增,移植到大鼠纹状体内存活良好并能分化成神经元、神经胶质细胞,且能定向分化为多巴胺能神经元。     

牛磺酸对胚胎中脑细胞移植后的保护作用

①目的　观察牛磺酸对帕金森病 (PD)模型大鼠胚胎中脑细胞移植术后移植细胞的存活及生长的影响。②方法　应用 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)制备偏侧损毁的PD模型大鼠 ,将胚胎腹侧中脑 (VM )细胞悬液或生理盐水 (NS) (对照组 )立体定位移植到模型大鼠的损毁侧纹状体中 ,VM移植大鼠于术后侧脑室分别注射NS或牛磺酸 ,5 6d后通过免疫组织化学酪氨酸羟化酶 (TH)染色观察纹状体中多巴胺 (DA)能神经元 (TH阳性细胞 )的存活及生长情况。③结果　行胚胎中脑细胞移植术后 ,在PD模型大鼠的损毁侧纹状体中可检测到移植成活的DA能神经元 ,侧脑室注射牛磺酸组比侧脑室注射NS组细胞成活数目明显增多 (F =5 0 8.5 ,q =3.9,P <0 .0 1)。而在对照组模型大鼠的损毁侧纹状体中未检测到DA能神经元。④结论　牛磺酸可有效改善移植细胞的存活条件 ,并促进移植细胞的生长。     

胚鼠黑质细胞悬液移植于帕金森病模型鼠侧脑室的实验研究

将胚鼠中脑腹侧组织制成细胞悬液移植于帕金森病(PD)模型鼠侧脑室,动态观察受体鼠在移植前后的行为变化。移植后16周应用诱发荧光及免疫细胞化学等方法,对移植物在受体鼠脑内的存活及生长情况进行了研究。结果,受体鼠旋转行为明显改善,侧脑室内可见黄绿色荧光细胞及酪氨酸羟化酶(TH)免疫反应阳性细胞,有的发出突起伸向室管膜及迁于尾核区.提示:移植的胚鼠黑质细胞生长良好,似作为触液神经元发挥其作用。     

PD大鼠纹状体提取液诱导中脑神经干细胞分化为多巴胺能神经元的研究

目的研究PD大鼠纹状体提取液诱对中脑神经干细胞的诱导分化作用.方法①体外分离、培养大鼠胚胎的中脑神经干细胞,并诱导其分化,巢素(Nestin)、神经丝-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色鉴定.②加入纹状体提取液后,分化细胞用抗酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化鉴定,并用流式细胞技术检测分化比例.结果①从大鼠胚胎的腹侧中脑部位分离获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的细胞团,且能分化为神经元和神经胶质细胞.②经纹状体提取液诱导后,能够分化出多巴胺能神经元,分化比例达20%左右.结论纹状体提取液能诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.     

乳鼠胰腺间质细胞培养上清对骨髓间充质干细胞分裂增殖的抑制作用

目的探讨乳鼠胰腺间质上清液是否对骨髓间充质干细胞分裂增殖产生影响。方法取出生4d乳鼠胰腺组织进行组织培养（对第一代细胞进行于／祖性质鉴定,进行早期干／祖特性的标记OCT4、SOX2免疫荧光染色,之后进行胰腺内分泌相关的mRNA水平检测Ngn3、PDX1、InsulinⅠ、InsulinⅡ,取上清用于诱导）。取6周龄大鼠骨髓进行间充质干细胞bone mesenchymal stem cells,BMSCs）培养,并取第二代细胞进行诱导实验。将上清置于BMSCs’中进行诱导培养,观察BMSCs的形态和生长分化情况。结果乳鼠胰腺中存在SOX2阳性干／祖细胞,并且具有向胰腺方向分化的Ngn3的mRNA表达,其上清影响BMSCs生长分化,但是BMSCs中未出现胰岛素因子的表达。结论乳鼠胰腺间质细胞可以分泌抑制BMSCs生长分化的成分。     

内皮祖细胞移植对扩张型心肌病大鼠血管新生的影响

目的 探讨内皮祖细胞（EPC）对扩张型心肌病大鼠心肌内血管新生的影响。方法 50只雌性SD大鼠于腹股沟皮下注射异丙肾上腺素,250mg/kg,连续2d,制作扩张型心肌病（DCM）模型。随机分为EPC治疗组和对照组;心脏彩超评估心功能情况免疫组化方法检测心肌细胞内的血管密度。结果 细胞移植3个月后EPC组心肌内血管密度高于对照组。结论 心肌内移植EPC是治疗扩张型心肌病的有效方法,安全,可行。     

FoxO4在血管紧张素Ⅱ诱导的内皮祖细胞凋亡中的机制研究

目的探讨转录因子FoxO4参与血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的内皮祖细胞（EPCs）凋亡的机制。方法从人脐静脉血中提取单个核细胞,血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导培养7d后鉴定为EPCs。AngⅡ诱导EPCs凋亡,加入AT受体拮抗剂（氯沙坦钾＋PD123319）进行干预。实验分为对照组、AngⅡ组和AngⅡ＋氯沙坦钾＋PD123319干预组。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;免疫组织化学方法观察FoxO4在各组EPCs的表达水平。结果AngⅡ可以诱导EPCs凋亡,通过AT受体拮抗剂阻断干预降低了EPCs的凋亡。免疫组织化学显示FoxO4在对照组中低表达,AngⅡ组表达最高,AngⅡ＋氯沙坦钾＋PD123319干预组中表达水平显著降低,其表述趋势与各组EPCs凋亡率的变化一致。结论AngⅡ可诱导EPCs凋亡,FoxO4转录因子参与了高浓度AngⅡ诱导的EPCs凋亡过程。     

电针大鼠胃经穴的血清对胃黏膜细胞表皮生长因子受体后信息物质表达的影响

目的:探讨电针大鼠胃经穴后提取的血清对胃黏膜细胞表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)后信息物质磷脂酶Cγ-1(phospholipase Cγ-1,PLCγ-1)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和c-myc表达的影响。方法:60只大鼠随机分为正常组、胃经组、胆经组、胃经 PD153035组和胆经 PD153035组,采用水浸束缚法制作胃黏膜损伤大鼠模型,链霉蛋白酶消化法分离胃黏膜细胞,分别用EGFR抑制剂PD153035和血清孵育胃黏膜细胞,应用酶联免疫吸附法检测PLCγ-1活性,同位素掺入法检测PKC活性,逆转录聚合酶链反应法检测c-myc的表达水平。结果:正常组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1、PKC和c-myc有微弱表达;胃经组和胆经组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1、PKC和c-myc呈现较强表达,其中胃经组大鼠表达最强烈,两组相比,差异有统计学意义(P<0.01);胃经 PD153035组和胆经 PD153035组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1、PKC和c-myc的表达较弱,胃经组与胃经 PD153035组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:电针胃经穴后提取的血清能诱导大鼠胃黏膜细胞EGFR后信息物质的活化,提示存在经脉-脏腑的特异性联系。     

人类中脑神经祖细胞的体外扩增及诱导分化

目的：探讨人类中脑祖细胞体外分离、培养及向多巴胺能神经元诱导分化的方法。方法：利用neurosphere法，在低氧分压的情况下建立中脑祖细胞克隆，并用纹状体培养上清对其进行诱导分化，观察TH阳性神经元的分化比率及成熟度。结果：中脑来源的神经祖细胞克隆，能以neurosphere形式生长，低氧分压对其克隆生长具有促进作用；纹状体培养上清可增加TH阳性神经元的分化比率，并能使TH阳性细胞具有更成熟的多巴胺能神经元的形态特征。结论：低氧分压更适于中脑神经祖细胞的体外扩增，纹状体培养上清对中脑祖细胞向多巴胺能神经元的分化及成熟具有促进作用。