手足口病从感染到发病的分子机制

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种常见的儿童传染病,在世界范围内爆发流行,严重危害儿童健康。HFMD由20多种肠道病毒引起,其中最主要的为肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)型。大量的研究表明,手足口病取决于病毒、宿主和环境等因素的共同作用。病毒入侵后逃逸宿主天然免疫或获得性免疫反应的监视,引起各种病理反应。这不仅涉及病毒自身的感染特性,也与宿主相关基因,如受体基因、免疫反应基因有密切关系。最近几年,手足口病致病相关宿主基因的研究成为热点,但是这些基因多与地域、种族、人群密切相关,不同地域或者相同地域的不同人群的研究结论常常不尽一致。因此,寻找与HFMD密切关联,广泛适用的致病相关宿主基因很有必要。遗传多样性小鼠(genetic diversity mice)是模拟人群基因多样性、研究复杂性状或疾病的新型工具。本文对已报道的HFMD致病相关宿主基因的研究工作作综述,并对遗传多样性小鼠在HFMD研究的重要作用和意义作展望。     

EV71临床分离株BALB/c小鼠致病特点分析

目的 将肠道病毒71型(EV71)临床分离株接种小鼠观察其致病特点.方法 将6株EV71临床株分别腹腔接种1日龄BALB/c小鼠,观察小鼠表现以及脑、肺脏、骨骼肌组织病理变化;采用免疫组化和RT-PCR方法,检测组织中病毒抗原和基因片段.结果 临床分离的6株EV71(C4亚型)接种1日龄小鼠均出现病症,其中JN200804株实验小鼠症状较重,小鼠脑组织和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化;JN200804株感染组小鼠脑内检测到EV71抗原和基因片段.结论 6株EV71临床株均可感染小鼠并致病,重者出现松弛型麻痹并死亡,轻者出现震颤、麻痹但可恢复至正常.     

RNA编辑酶ADAR1对EV71感染及变异的影响

 目的 研究RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶 (adenosine deaminase acting on RNA,ADAR1)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及变异的影响。方法  运用RNAi技术筛选ADAR1基因沉默稳定细胞株,通过MTT分析病毒感染后细胞活力变化、噬斑形成分析病毒滴度及细胞对病毒的敏感性,以及Western blot测定病毒蛋白表达水平等,分析ADAR1对EV71感染的影响。由于ADAR1介导的RNA编辑可使基因形成A-G或T-C突变,为确定ADAR1影响EV71感染是否与其编辑EV71基因组导致病毒变异有关,对EV71流行区EV71的突变特征进行分析;并利用EV71感染ADAR1基因沉默细胞,通过对病毒基因组测序分析,研究ADAR1是否直接编辑EV71基因组。结果   ADAR1基因沉默后,与对照细胞相比,病毒感染细胞的存活率下降更快,并形成更多、更大的噬斑。病毒感染细胞中的VP1蛋白和细胞培养基上清中的病毒滴度均明显增加。EV71突变特征分析表明,虽然A-G和T-C之间的变异是病毒突变的主要类型,但EV71感染实验初步证明,ADAR1并不直接编辑EV71病毒基因组。结论ADAR1可能具有抗EV71感染的作用,但ADAR1可能并不直接编辑EV71基因组。     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的 人肠道病毒71型( EV71)感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症.建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础.方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10.使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测.结果 与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell,RD细胞)的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡.病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变.病理分析发现:感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一.结论 建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具.     

EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的 用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具.方法 用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株.以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定.结果 与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1 d和5 d达到高峰.EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化.免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布.结论 阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价.     

人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的细胞实验证实人清道夫受体B2(hSCARB2)是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型。方法构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠。通过Western Blot和免疫组化检测目的蛋白在各组织中的表达。EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的蛋白表达对病毒感染的促进效果。结果人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍。结论人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能。     

镇江地区肠道病毒71型VP1基因的检测及系统进化分析

目的检测我国镇江地区2008年手足口病(HFMD)散发病例中的肠道病毒71型(EV71),并进行毒株的种系进化分析。方法采集临床HFMD患者粪便标本,抽提病毒RNA,通过巢式聚合酶链反应技术进行特异性扩增。经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本,采用EV71特异性引物对其VP1区的核苷酸序列进行扩增。扩增的VP1片段经纯化后与测序载体PET32a(+)连接,转化大肠埃希菌DH5α,并对阳性质粒进行酶切和测序鉴定。利用Clustalx和MEGA4.0分析软件,进行系统进化分析。结果通过聚合酶链反应扩增获得EV71VP1基因,根据遗传进化分析发现该病毒株与1999、2000年在美国亚特兰大以及2000年中国北京地区流行的EV71型遗传距离较近,均属于C型。结论镇江地区HFMD患者中分离的EV71病毒株属C基因型。     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征,为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病(HFMD)患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega5.0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果 154份,阳性率为51.33%;CoxA16阳性结果 38份,阳性率为12.67%。测序结果表明,8株EV71之间的VP1基因核苷酸同源性为96.9%~99.2%,氨基酸同源性为99.3%~100%。VP1区基因遗传进化分析表明,8株EV71分离株与C4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

IFN-γ＋874位点单核苷酸多态性和蛋白表达水平与肠道病毒71感染关系

目的 研究干扰素Ⅱ型(IFN-γ)基因+874位点单核苷酸多态性及IFN-γ在血清中表达水平与肠道病毒71 (EV71)感染的关系,探讨EV71感染的遗传易感因素.方法 取急性期手足口病病儿粪便进行病毒分离,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)技术检测EV71感染者及正常对照儿童IFN-γ基因第一内含子+874位点T/A单核苷酸多态性;ELISA法测定血清中IFN-γ的表达水平.结果 78例手足口病病儿中有43例为EV71感染.EV71感染病儿血清中IFN-γ的水平显著高于正常对照组(t=6.477,P<0.01).EV71感染病儿IFN-γ基因型与对照组比较差异有显著性(χ2=6.149,P<0.05).EV71感染病儿等位基因频率与对照组比较差异有显著性(χ2=7.486,P<0.05).EV71一般感染组IFN-γ基因型分布与脑炎组相比,差异无显著意义(P＞0.05),脑炎组IFN-γ等位基因A频率明显高于一般感染组(χ2=6.211,P<0.05).结论 IFN-γ表达水平和其基因第一内含子+874位点多态性与EV71感染有关,与是否发生EV71脑炎有一定相关性.     

白细胞介素6在EV71相关手足口病中的作用

肠道病毒71型(EV71)是导致婴幼儿手足口病的主要病原体,EV71感染可以导致重症手足口病和严重的神经系统并发症,脑干脑炎、神经源性肺水肿是EV71感染后最严重的并发症,也是导致死亡的主要原因,全身炎症反应综合征被认为与感染者病情危重相关,大量病毒诱导的炎性因子可能是EV71感染的致病机制。静脉给予人免疫球蛋白可以起到调节免疫反应的作用,并改善EV71导致的肺水肿患者的预后。其中白细胞介素6(IL-6)在EV71感染者体内中浓度水平升高,而在动物模型中给予抗IL-6治疗可以缓解症状,改善动物预后。     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

EV71感染SK-N-SH细胞相关基因的鉴定

目的:鉴定肠道病毒EV71型感染SK-N-SH细胞相关基因的改变。方法:EV71感染SK-N-SH细胞后,收集细胞做基因微阵列分析,并对差异表达的基因进行Real-time PCR和ELISA鉴定。结果:共有86个基因mRNA的转录表达改变。上调表达的基因涉及细胞因子、趋化因子、泛素蛋白以及Toll样受体信号途径、P53信号途径、凋亡途径、白细胞穿越内皮细胞、MASP信号途径和Jak-STAT信号途径等相关基因。Real-time PCR和ELISA验证了差异显著基因的高表达。结论:本研究结果提示EV71感染后的高致死率可能与一系列释放细胞因子和趋化因子的免疫反应有关,对更好地理解感染EV71病毒后机体的免疫反应提供了参考,并提供了阻断和控制EV71感染潜在的治疗策略。     

肠道病毒感染致神经损伤小鼠脑组织NOD样受体蛋白3的表达

目的:探讨NOD样受体蛋白3(NLRP3)在肠道病毒(EV)感染导致的神经损伤中的作用.方法:30只BALB/c小鼠分为对照组、肠道病毒(EV)71组和柯萨奇病毒A组2型(CVA2)组,每组10只.EV71组和CVA2组小鼠分别经腹腔注射EV71或经肌内注射CVA2,观察临床症状和生存情况.感染后第7天,采用HE和尼氏...     

河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析

目的:了解2010年河南省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征.方法:筛选2010年河南省分离的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010),进行全基因组序列测定和基因进化特性分析.结果:EV71/Henan/DC/2010与其他EV71病毒株相比,编码区无核苷酸的缺失或插入,5'UTR区和3'UTR区...     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

形觉剥夺树鼩视皮质17区的可塑性

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性.方法 通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定.用EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况.结果 通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞.EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似.结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台.     

深圳市手足口病重症感染性克隆的构建和分析

目的构建肠道病毒71型(EV71)的感染性克隆,为EV71致病机理的研究和药物的开发建立技术平台。方法选取临床手足口重症儿童粪便样品,经荧光定量PCR检测为阳性,RT-PCR方法扩增出EV71全基因组,通过TA克隆的方法连接到TOPO-XL-PCR载体中,应用T7聚合酶系统将线性化的EV71DNA序列体外转录成RNA,转染人横纹肌肉瘤细胞系RD-A细胞,病毒传代并观察病变,通过间接免疫荧光实验进一步鉴定,获得的感染性克隆进行全基因组测序和序列比对分析。结果 RT-PCR可以获得EV71全长约7.5kb的DNA片段,体外转录并转染后3～5d可观察到典型的肠道病毒致细胞病变,免疫荧光可看到特异标记,序列比对为C4a亚型的EV71病毒。结论构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,在分子生物学水平上有利于深入研究EV71的致病机制和毒力基因、患者抗体的中和特性、疫苗和药物的效力评估与开发等。