慢性支气管炎对离退休干部生活功能的影响

目的　探讨驻皖部队离退休干部中慢性支气管炎的发病和对日常生活功能的影响 ,为其生活质量的改善提供科学依据。方法　采用问卷调查和体格检查相结合的方法随机调查驻皖部队离退休干部 767例。结果　 767例中有 2 3 9例患有慢性支气管炎 ,占 3 1.16% ,位于其调查的老年慢性疾病患病率的第 5位 ,且慢性支气管炎患者的日常生活功能损伤较对照组显著 (P <0 .0 1)。调查者的年龄、吸烟状况、睡眠时间、文化程度及娱乐活动等与老年慢性支气管炎的发病密切相关。结论　慢性支气管炎对老年人日常生活功能的损害较严重 ,普及健康教育及改变生活习性有利于提高患者的生活质量。     

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的 自1例死亡患儿的标本中分离EV71,并分析其全基因组序列特点,研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关.方法 咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿,在人横纹肌瘤细胞(RD)上分离EV71,分段扩增获得EV71的全序列,用BLAST、Bioedit和MEGA 4进行序列分析.结果 获得1株EV71分离株SDLY107,基因组全长7405 bp,全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang.Anhui.P.R.C/17.08/2同源性最高,为98.6%,与原型株BrCr/70的同源性为80.0%,与神经毒型株MS/87的同源性为86.5%.系统进化分析表明,SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近,按照传统的VP1基因分型方法,可归为C4亚型,是近年来我国大陆流行的主要基因亚型.氨基酸序列分析发现,SDLY107与其他毒株相比,有2个特有的突变(E947D,K1873R).结论 SDLY107分离株属于C4亚型,氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关.

Abstract：

Objective To isolate enterovirus 71 from a death children,and analyze whether the neurovirulence was related to the variation of nucleotide and amino acid. Methods Enterovirus 71 was isolated from throat swabs which were colleted from Shandong Linyi People's Hospital. The full length genome was sequenced by amplification with RT-PCR and sequencing of 9 overlapped gene fragments covering full length of the genomes. The nucleotide and amino acid sequenced was aligned by BLAST, Bioedit and MEGA 4. Results A strain of enterovirus 71 was isolated and named as SDLY107. The full length was 7405 bp. The results of homology analysis of overall nucleotide sequence showed that strain Fuyang. Anhui. P. R. C/17.08/2 had highest homology (98.6%)with strain SDLY107, and the homology was 80.0% between strain SDLY107 with prototype strain BrCr/70,and 86. 5% between strain SDLY107 with nerve strain MS/87. Phylogenetic analysis showed that the phylogeny was close between SDLY107 with some isolated strains from Chinese Mainland, such as Beijing, Henan, Guangxi, Sbenzhen, Lanzhou, Fuyang, Chongqing and Zhejiang strains, which was clustered for C4 subtype. The results of amino acid sequence analysis showed that there were 2 mutations, E947D and K1873R, for strain SDLY107. Conclusion SDLY107 belonged to C4 subtype, amino acid mutations E947D and K1873R of which may be relevant to the pathogenicity of EV71.     

济南市售小米和玉米中赭曲霉素A污染状况研究

目的 了解济南市售小米和玉米中赭曲霉毒素A的污染情况。方法 采用竞争抑制酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测小米和玉米中赭曲霉毒素A的提取溶剂、检测条件、回收率等,并对其进行优化研究,并利用优化出的条件对济南市5个区市售小米和玉米中赭曲霉毒素A含量进行检测并评价。结果 含有5%氯化钠的60%甲醇水溶液对谷物中赭曲霉毒素A的提取效果较为理想,检测的所有样品中,小米、玉米赭曲霉毒素A检出率分别为41%和38%,其中,超市小米赭曲霉毒素A检出率（56%）明显高于集市小米（26%）(P＜0.05)。赭曲霉毒素A污染水平在0.40～4.45μg/kg之间,中位数为1.67μg/kg, 集市和超市出售的小米、玉米中赭曲霉毒素A污染水平均无统计学意义(P＞0.05)。本次检测所有样品中的赭曲霉毒素A含量均未超过国家规定的粮食中赭曲霉毒素A的限量标准。结论 济南市售的小米和玉米中均不同程度地存在赭曲霉毒素A污染,但污染水平均未超过国家标准。     

肠道病毒71型3CD蛋白对细胞的损伤作用

目的 研究肠道病毒71型(EV71)3CD蛋白在致病机制中的作用。方法 实验分为对照组、SDLY1组、SDLY107组和SDLY107(1-3CD)组。通过反向遗传技术将弱毒株SDLY1株的3CD蛋白编码区置换到强毒株SDLY107株,形成拯救病毒SDLY107(1-3CD)株。将EV71病毒接种于RD细胞和Vero细胞,于37℃和39.5℃孵育一定时间后,采用MTT试验检测活细胞量,以判断病毒对细胞损伤作用的改变。结果 37℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)对细胞的损伤作用弱于SDLY107株,但仍强于SDLY1株(P<0.05);39.5℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)株对细胞的损伤作用较SDLY107株下降(P<0.05),但与SDLY1株的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV713CD编码区的置换可以改变病毒对细胞的损伤作用,3CD蛋白编码区可能存在影响病毒毒力的位点。这一发现有助于理解EV71的致病机制。     

艾滋病痴呆综合症患者体内HIV-1 tat基因的克隆及原核表达

目的     探讨艾滋病痴呆综合症（AIDS dementia complex,ADC）患者体内外周和中枢不同组织部位的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）反式激活因子（tat）第一外显子基因序列的变异并对其进行表达,用于研究HIV-1 Tat变异对其神经毒性的影响。方法     从ADC病例尸检标本的脾脏（spleen,SPL）、脑膜（meninges, MG）和基底核（basal ganglia,BG）3个部位的组织中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出tat第一外显子基因,并将其插入到pGEM-T克隆载体中,测序证实为HIV-1 tat基因,BioEdit软件对测序结果进行比对。将克隆载体双酶切,回收目的基因,并将其连接到pGEX-KG表达载体中,将重组表达质粒pGEX-KG-tat转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,表达产物用SDS PAGE和Western blot进行检验和鉴定。结果    成功克隆了HIV-1 tat第一外显子基因,序列比对发现外周和中枢部位的Tat氨基酸序列不同;构建了pGEX KG-tat重组表达载体,并在原核细胞中高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合Tat蛋白,SDS PAGE和Western blot分析表明,所表达的蛋白为Tat蛋白。结论     ADC患者外周和中枢不同组织部位的HIV-1 tat第一外显子基因所编码的Tat蛋白氨基酸序列存在变异,在原核细胞中对其进行了高效表达,为Tat蛋白的神经毒性研究奠定了基础。     

人季节性H1N1流感病毒小鼠感染模型的建立

目的制备人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,为研究流感病毒致病性、研发抗病毒药物提供模型动物。方法将人季节性H1N1流感病毒在鸡胚尿囊腔扩增后,滴鼻接种小鼠,4 d后将小鼠处死,挑选感染体征严重者进行实时荧光PCR(FQ-PCR)检测肺中的流感病毒,将检测阳性的肺上清在鸡胚尿囊腔扩增,接种于下一代小鼠。比较各代小鼠对流感病毒的适应情况,直至小鼠出现明显的感染体征,取肺研磨制成匀浆,获得流感病毒鼠肺适应株并检测其半数致死量(LD50)。将10 LD50的病毒液接种于小鼠,建立人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,观察模型小鼠的一般活动状态、体质量变化、肺部病变,HE染色观察肺部病理切片,计算肺指数,FQ-PCR检测病毒RNA。结果人季节性流感病毒在小鼠体内传代4次后,鼠肺适应株制备完成,其经鼻的LD50为10-2.41/0.05 mL。人季节性流感病毒的小鼠感染模型,一般状态差,体质量明显减轻,肺指数增大,70%出现死亡。病理切片观察病变明显,FQ-PCR显示流感病毒阳性。结论成功建立了人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步确定

目的  初步确定汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上潜在的融合肽区域。  方法  采用基因定点突变技术将潜在融合肽区域的十个关键氨基酸突变成性质相左的氨基酸,转染Vero E6细胞后,间接免疫荧光（IFA）检测糖蛋白表达,采用Giemsa染色法观察细胞融合现象。  结果   在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白,IFA显示关键氨基酸突变前后细胞中均有荧光信号,呈胞浆分布,但细胞融合现象在突变后消失。  结论 潜在融合肽区域的十个氨基酸突变均对细胞融合产生明显的影响,提示该段区域很可能是病毒的融合肽。     

发热伴血小板减少综合征病毒致细胞程序性死亡的研究

目的研究发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)感染致细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)形式, 并进一步于蛋白水平探讨细胞焦亡的存在, 为研究SFTSV致病机制提供新的思路。方法用不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)SFTSV感染Vero细胞, 逐日观察细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), CCK-8法检测细胞活力、LDH释放试验检测细胞膜受损情况, 以判定病毒的最佳感染量与细胞死亡时间。使用不同PCD抑制剂分别对Vero细胞进行预处理后感染SFTSV, CCK-8法检测细胞活力, 判断SFTSV致PCD死亡形式。采用Western blot检测细胞焦亡相关蛋白的含量, 进一步探讨焦亡的存在。结果 SFTSV以MOI=10感染Vero细胞后48 h、72 h为后续实验最佳感染量与时间, 此时细胞CPE明显, 细胞活力降至对照组的51%、41%(P<0.001、P<0.001...     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。