脂肪组织源性干细胞分步诱导分化为神经元样细胞

目的探讨脂肪组织源性干细胞(ADSCs)诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法 ADSCs分离自雄性SD大鼠附睾脂肪垫,差速贴壁法纯化ADSCs,传至第3代培养细胞行流式细胞术行表型鉴定(CD106,CD11b,CD45,CD90,CD29,CD49d),并进行成脂诱导。取鉴定后的ADSCs用分步诱导法,即先用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、2%B27的DMEM/F12培养基I培养,诱导其向神经干细胞转分化,再用含10 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),10 ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF),1μmol/L维甲酸(RA)的培养基II诱导分化为神经元样细胞(NLCs),免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物巢蛋白(nestin),神经细胞特异性标志微管相关蛋白(MAP2),神经元核蛋白(NeuN)。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD29表达强阳性;成脂诱导分化后细胞油红O染色阳性;ADSCs经培养基I培养7 d后聚集成球样细胞团悬浮于培养液中,表达nestin;继而用培养基II诱导分化4 h后细胞球逐渐贴壁,球周边少数细胞向外发出突起,形似神经元,MAP2、NeuN均呈阳性。结论特定条件下,ADSCs在体外可被逐步诱导分化为NLCs。     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

大鼠脂肪源性干细胞来源的施万样细胞的增殖能力

目的：通过检测大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）来源的施万样细胞的增殖能力,探讨其在神经修复再生领域的应用及其意义。方法：取大鼠附睾旁脂肪组织进行ADSCs的分离与培养;将第4代ADSCs在β-巯基乙醇（β-ME）、反式维甲酸（ATRA）、血小板衍生因子AA（PDGF-AA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin）和Heregulin-β的联合作用下诱导分化为施万样细胞。采用免疫荧光法、Western blotting法和Real-time PCR法检测施万细胞（SCs）标记物S-100β、P75和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达水平;采用MTT法检测施万样细胞的增殖能力,观察其有丝分裂增殖现象。结果：诱导分化后的施万样细胞呈梭形、栅栏样排列。S-100β、P75和GFAP蛋白免疫荧光为Cy3/FITC标记,阳性产物位于细胞浆及其突起。Western blotting和Real-time PCR法检测,施万样细胞中S-100β、P75和GFAP蛋白和mRNA表达水平明显高于ADSCs（P<0.01）。MTT法检测,施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力。结论：ADSCs能够成功被诱导分化为施万样细胞,并表达SCs标记物;施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力,可作为神经组织工程理想的种子细胞。     

脂肪干细胞的分离培养及相关研究

目的研究脂肪干细胞的体外培养方法和生物学特性。方法原代ADSCs培养取材自5月龄健康新西兰大白兔。Giemsa染色观察培养细胞形态，CD34，CD44，CD105抗体标记，运用流式细胞仪进行ADSCs鉴定。使用第3代细胞，加入含有10ng／mLTGF-β1的培养基向软骨细胞诱导，连续诱导1周；应用含有10umol／L的5-aza的完全培养液向心肌细胞诱导。番红花O染色和二型胶原染色鉴定软骨细胞表型；横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T免疫细胞化学染色鉴定心肌细胞特异性抗原。结果流式细胞仪检测结果示，第3代ADSCs高表达间充质干细胞特异抗原CD44、CD105，不表达CD34；经TGF-β1诱导1周后，ADSCs呈软骨细胞样生长，番红花O染色和二型胶原染色阳性；经5-aza诱导24h后，细胞形态变为不规则星状及杆状，类似于心肌样细胞生长。诱导后21d免疫细胞化学检测横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性。结论ADSCs是真正意义上的间充质干细胞，具有良好的多向分化潜能，在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景。     

不同方法诱导脂肪干细胞分化为类施万细胞

目的寻求一种有效的方法将脂肪干细胞在体外诱导分化为类施万细胞。方法采用2种不同的诱导剂使用方法诱导大鼠脂肪干细胞,从形态学、抗S-100、抗GFAP免疫细胞化学染色阳性率、染色灰度值,MTT法细胞活性测定来比较其效果的不同。结果2种方法均可有效地诱导大鼠脂肪干细胞分化为类施万细胞,改良法诱导的细胞在形态上更接近施万细胞,抗S-100、抗GFAP阳性率、染色灰度值均优于传统法;MTT细胞活性测定显示改良法对细胞活性影响较小。结论改良法体外诱导大鼠脂肪干细胞的效果优于传统法。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞的基本生物学特性及其向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化潜能。方法取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,胶原酶消化法分离出脂肪干细胞,体外培养。取第3代细胞,免疫细胞化学测定其CD44、CD34抗原表达,分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化。油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色鉴定其分化能力。结果大鼠脂肪干细胞生长能力旺盛,表达CD44,而不表达CD34;定向诱导后,油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色阳性。结论大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪干细胞,能向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化,有可能成为组织工程理想的种子细胞来源之一。     

成人外周血间充质干细胞诱导为神经元样细胞的体外研究

目的:研究成人外周血间充质干细胞分化为神经元样细胞的潜能。方法:体外培养成人外周血中分离出的间充质干细胞,传代纯化后收集第2代细胞。细胞经预诱导及全反式维甲酸再诱导后,通过免疫细胞化学法鉴定诱导后的神经元样细胞。结果:诱导后外周血间充质干细胞分化为具有典型神经元形态的细胞,免疫细胞化学显示细胞神经元烯醇化酶阳性率68%;细胞神经巢蛋白阳性率55%;细胞胶质纤维酸性蛋白表达均阴性。结论:成人外周血间充质干细胞在体外可诱导分化为神经元样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法:体外分离培养人牙周膜细胞,光镜下及HE染色鉴定细胞形态学特征。免疫组化法检测波形蛋白、角蛋白、CD44的表达。成骨诱导法培养人牙周膜干细胞向成骨细胞分化。结果:体外成功分离培养人牙周膜干细胞。角蛋白阴性表达,波形蛋白阳性表达,CD44阳性表达。诱导成骨结果显示人牙周膜干细胞具有潜在的多向分化潜能。结论:人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为成骨样细胞,具有多向分化的潜能。     

盐酸法舒地尔在脂肪干细胞向表皮细胞诱导分化中的作用

目的探讨盐酸法舒地尔(HA1077)在脂肪干细胞(ADSC)向表皮细胞诱导分化中的作用。方法用酶消化法消化人脂肪组织获取ADSC,以基础培养基即体积分数含10%胎牛血清的DMEM培养基传代,取生长良好达到90%融合的第3代人ADSC分为4组,第1组持续用基础培养基培养、传代;将第2、3、4组弃基础培养基,无菌磷酸盐缓冲溶液冲洗,分别换用培养液2(基础培养基+20μmol.L-1 HA1077)、培养液3(体积分数70%的基础培养基+体积分数30%的成纤维细胞培养基上清液+10 ng.L-1重组人表皮生长因子)、培养液4(20μmol.L-1 HA1077+培养液3),诱导后经免疫细胞化学、流式细胞仪检测CK19的表达。结果免疫细胞化学分析表明ADSC表达CD44、CD49d,而不表达CD106、CD34、CK19;流式细胞仪检测CD44、CD49d的阳性率分别为(98.84±0.02)%、(92.52±0.04)%。流式细胞仪检测各组CK19的表达阳性率分别为(0.23±0.01)%、(0.35±0.02)%、(9.73±0.80)%、(17.65±1.00)%,其中第3、4组CK19的阳性率较对照组明显增高,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论 HA1077对ADSC向表皮细胞诱导分化有促进作用。     

Optimal in vitro culture conditions for murine predominant immature CD8a+ dendritic cells

Background The prospects of using immature CD8a^＋ dendritic cells （DC2） to establish transplant immunologic tolerance and treatments for autoimmune diseases in the future are promising. However, the methods for inducing DC2 are still being explored. The present study was aimed to investigate the optimal in vitro conditions for preparing large numbers of predominant DC2 from murine bone marrow cells. Methods Three groups of bone marrow cells cultured under different conditions were examined, namely a cytokine-induced experimental group （cytokine group）, a control group with a low concentration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor （GM-CSF, low GM-CSF group） and a control group without endogenous cytokines. The cytokine group was cultured with 5 ng/ml GM-CSF, 25 ng/ml Fit3 ligand （FIt3L）, 20 ng/ml interleukin 4 （IL-4） and 100 ng/ml stem cell factor （SCF）. The low GM-CSF control group was cultured with 0.4 ng/ml GM-CSF, 25 ng/ml FIt3L and 100 ng/ml SCF, without IL-4. The control group without exogenous cytokines was cultured without additional cytokines. All cells were cultured at 37℃ under 5% CO2. On days 3, 7 and 16, 4-color flow cytometry was carried out to analyze the cell phenotypes, and the total cell numbers were counted to analyze the cell yields. Phase-contrast microscopy was used to observe the cell morphologies. Results The cytokine group exhibited higher proportions of typical immature CD8a^＋ DC, especially on day 3, but the total cell number and DC2 proportion decreased during prolonged culture. The low GM-CSF control group showed the same tendencies as the cytokine group on days 16 and 22, but produced higher total cell numbers （P 〈0.05） with lower DC2 proportions and cell numbers. The control group without exogenous cytokines spontaneously generated a certain proportion of DC2, but with low total cell and DC2 numbers that decreased rapidly, especially during prolonged culture （days 7 and 16, P 〈0.05）, Conclusions Culture in the presence of 5 ng/ml GM-CSF, 25 ng/ml FIt3L, 20 ng/ml IL-4 and 100 ng/ml SCF can rapidly induce large quantities of predominant immature CD8a^＋ DC from murine bone marrow cells. Therefore, these represent optimal culture conditions for preparing murine immature DC2 in vitro.     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的：比较4种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖性差异。方法采用密度梯度离心法提取大鼠BMSCs ,分别在DMEM-LG培养基、DMEM/F12培养基、DMEM-LG＋10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）与DMEM/F12＋10 ng/mL bFGF培养条件下贴壁培养,观察各代细胞的形态特征,绘制第4代细胞的生长曲线,利用流式细胞仪对各培养条件下的BMSCs进行细胞表面标志CD45、CD29和CD90的检测。结果不同培养条件下的 BMSCs 生长速度不同。加入 bFGF 培养条件下细胞增殖速度较单用 DMEM -LG 或DMEM/F12培养条件下更快（P＜0．05）。 DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF的培养效果最佳,细胞密度高,生长状态良好。4种条件下培养的细胞均阳性表达CD29及CD90,阴性表达CD45。结论短期培养过程中加入bFGF不引起BMSCs分化,DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF是较理想的BMSCs培养条件。     

人参多糖定向诱导脐血来源树突状细胞及鉴定

目的探讨人参多糖（Ginseng Polysaccharides,GPS）对脐血来源树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）体外诱导生成及增殖的影响。方法采集脐血抗凝,离心获得单个核细胞,用含胎牛血清（Fatal Calf Serum,FCS）的培养基贴壁培养3h,分别予含GPS和细胞因子（Cytokine,CK）的培养基进行培养,显微镜观察各组细胞形态,台盼蓝染色法计活细胞数,流式细胞术检测第12 d细胞免疫表型CD80、CD83、CD86的表达。结果脐血单个核细胞体外经GPS诱导培养后细胞数量显著增加,以浓度为100μg/ml第12 d时增殖最显著（P〈0.05）,细胞形态典型,高表达免疫表型CD80、CD83、CD86（P〈0.01）。结论GPS可从脐血单个核细胞体外诱导出DC,并经形态学及表型鉴定得以证实。     

胰岛素样生长因子-1促进脂肪干细胞迁移能力的研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）对脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）迁移能力的影响,为勃起功能障碍的治疗建立实验基础。方法 采用酶消化法分离提取SD大鼠皮下脂肪干细胞,以含有10%的胎牛血清的DMEM培养基培养。通过流式细胞仪检测ADSCs表面标志物（CD34、CD44、CD45）的表达情况。采用终浓度为20ng/ml IGF-1预处理ADSCs,观察IGF-1对ADSCs迁移能力以及CXCR4蛋白的表达情况。结果 流式细胞术显示ADSCs的表型分子CD44呈阳性,CD34、CD45呈阴性。IGF-1可上调CXCR4的表达,并且促进 ADSCs向SDF-1迁移。结论 本实验成功分离培养ADSCs,IGF-1能够提高ADSCs表面CXCR4蛋白的表达,从而促进ADSCs迁移,并为下一步将IGF-1预处理的ADSCs应用于大鼠体内勃起功能障碍的治疗提供基础。     

同种异体富血小板血浆提取液对脂肪干细胞的体外促增殖作用

目的：观察不同浓度同种异体富血小板血浆(PRP)提取液对脂肪干细胞(ADSCs)体外增殖的影响,为将同种异体PRP提取液应用于创面修复提供实验依据。方法：取SD大鼠腹股沟脂肪组织进行原代及传代培养;通过将获得的细胞向脂肪、骨和神经方向诱导分化,鉴定其干细胞特性;三次离心法制备同种异体PRP提取液,加入DMEM/F12配制成6.67%、3.35%和1.67%的培养液;将第3代ADSCs分为4组：实验组(A、B和C组)分别以含体积分数为6.67%、3.35%和1.67%PRP提取液的培养液培养,对照组(D组)ADSCs用仅含10%胎牛血清、DMEM/F12的基础培养液培养;在培养24和48 h后采用MTT法观察ADSCs生长状态。结果：原代培养成功获得贴壁生长细胞,呈成纤维细胞样,并成功向脂肪细胞、骨细胞和神经细胞方向诱导分化,即具有多向分化潜能,证明所培养的细胞为ADSCs;酶标仪测定,A、B、C、D组在培养24 h后吸光度(A)值分别为0.434 3±0.084 3、0.351 6±0.076 6、0.258 1±0.060 0和0.259 2±0.073 6,在培养48 h后A值分别为 1.016 8±0.443 6、0.741 7±0.109 7、0.367 8±0.034 2和0.395 7±0.106 2; A组和B组的A值均高于C组和D组(均P<0.05);A 组的A值高于B组(P<0.05);C组A值与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。A和B组细胞增殖率明显升高,而C组细胞增殖率呈负增长。结论：适当浓度的同种异体PRP提取液可显著促进ADSCs体外增殖,有望应用于创面修复。     

小鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法。方法 采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12(1:1)液(包括15％FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆。应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin)。结论 分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞。     

脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究

目的 探讨大鼠脂肪干细胞(ADSC)的培养及诱导分化为成肌细胞的方法 .方法 取SD大鼠脂肪组织,酶消化法分离、培养ADSC,免疫荧光和流式细胞仪检测相关表面抗原CD90、CD105和CD34的表达.取培养至第2代处于对数生长期细胞,分别用含5-氮杂胞苷(5-aza)的诱导培养液(诱导组)和基础培养液(对照组)进行培养.诱导时间为7、14、21、28和35 d,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化,免疫荧光和流式细胞仪检测成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达.结果 成功从大鼠脂肪组织分离、培养出ADSC,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性.诱导组细胞诱导28 d后呈现成肌细胞特有的"漩涡"样生长形态,单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示,desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达最高,分别为52.57%和50.04%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 成功从大鼠脂肪组织分离、培养ADSC,含5-aza的诱导培养液可将其诱导分化为成肌细胞,诱导 28 d成肌细胞特异性抗原表达率最高.     

生长分化因子5促进脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

目的研究生长分化因子（GDF5）在诱导脂肪干细胞（ADSCs）成软骨分化中的作用。方法大鼠ADSCs在不同诱导条件下经细胞微团培养后,通过检测细胞增殖、糖胺聚糖和蛋白聚糖、软骨细胞特异性基因CollagenⅡ、AggrecanmRNA和蛋白质表达,以及软骨细胞肥大标志基因CollagenⅠ、CollagenⅩ的表达水平,比较不同浓度的GDF5（10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml）与TGFβ1（10ng/ml）对ADSCs成软骨分化的促进作用。结果 GDF5对AD-SCs成软骨分化过程中的细胞增殖具有显著的促进作用,同时还能增加细胞外基质糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量,以及上调软骨细胞特异性CollagenⅡ和Aggrecan基因和蛋白表达。在10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml的GDF5剂量组中以100ng/ml为最佳浓度,其效果显著优于10ng/ml的TGFβ1。结论本研究结果表明GDF5能够显著促进脂肪干细胞的成软骨分化,并且以100ng/ml的效果最为明显。