体外诱导的人脂肪间充质干细胞源性软骨细胞体内成骨活性

目的:目前对间充质干细胞向软骨细胞诱导分化主要包括体内诱导和体外诱导两种方式,前者依靠体内微环境,随机性大且难以进行监控和调整.本实验探讨体外诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,以及诱导后细胞在裸鼠体内的成软骨能力.方法:实验于2006-08/2007-05在中南大学湘雅医院中心实验室完成.①对象与材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,年龄25～64岁,对实验及治疗均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级裸鼠5只,体内成软骨实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.离心管容量20 mL,由GeneRay公司生产.②实验方法:将皮下脂肪组织剪碎,I型胶原酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞,待细胞铺满瓶底80%时胰酶消化传代.传至第6代时收集 5×106个细胞,用含1%新生牛血清、高糖DMEM、10 μg/L转化生长因子β1、37.5 mg/L维生素C、6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10-7 mol/L地塞米松的软骨细胞诱导剂重悬于无支架离心管内.③实验评估:诱导过程中观察细胞聚集状态.诱导2周后采用苏木精-伊红染色、RT-PCR、Western blot对细胞形态及功能变化进行检测.将诱导后细胞与纤维蛋白原凝胶混合,植入裸鼠皮下,3周后切取植入组织块,苏木精-伊红染色及II型胶原免疫组化染色观察体内成软骨情况.结果:①诱导后细胞聚集状态:诱导2 d后脂肪间充质干细胞自行聚集为一条状细胞团,1周后细胞团聚集呈球状.②苏木精-伊红染色结果:未见有软骨陷窝形成.③RT-PCR检测结果:细胞团内Ⅱ型胶原蛋白和Sox9 mRNA均呈阳性表达.④Western blot检测结果:细胞团内有较强的Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan表达.⑤体内成软骨情况:植入裸鼠皮下的组织块内有大量软骨陷窝及II型胶原蛋白形成.结论:①在无支架离心管内,脂肪间充质干细胞经软骨诱导剂作用后具有典型的软骨细胞表型,但未形成成熟软骨组织所具备的软骨陷窝.②诱导后细胞与凝胶复合种植于裸鼠体内,可形成具有典型软骨特征的组织.     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对血清饥饿引起成骨细胞增殖抑制的保护作用

目的探讨血清饥饿条件下成骨细胞的增殖及胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的作用。方法采用组织块培养法体外培养成骨细胞,分正常血清浓度组,血清饥饿组,IGF-Ⅰ组进行干预,观察细胞生长状态,MTT法检测细胞增殖。结果血清饥饿组成骨细胞贴壁减少,融合缓慢,增殖低于正常血清浓度组(P<0.01),IGF-Ⅰ组细胞增殖较血清饥饿组增加(P<0.01),低于正常血清浓度组(P<0.01)。结论血清饥饿抑制成骨细胞增殖,可能是缺血性骨病的发病机制之一。IGF-Ⅰ能部分改善由于血清饥饿引起的成骨细胞抑制。     

前路病灶切除钛网植骨内固定治疗下颈椎椎体转移瘤

目的 探讨前路病灶切除,并进行钛网植骨、钛板内固定治疗下颈椎椎体恶性肿瘤的临床应用价值.方法 采用前方入路行病灶清除、钛网植骨、钛板置入内固定及重建治疗18例下颈椎椎体转移瘤患者.采用Frankel、VAS进行评分,根据X线片评价椎体间高度及病椎段Cobb角的变化,记录术后并发症.结果 18例均得到随访,随访时间9～24个月(平均15.2个月).末次随访Frankel、VAS进行评分较术前均得到明显的改善;椎体间高度及Cobb角有明显恢复.局部肿瘤无复发,无术后感染及内固定松动、脱出、断裂等.术后1例出现声嘶,4例因多处转移、多器官功能损害、全身衰竭死亡.结论 经前路切除病灶、钛网植骨、钛板置入内固定及重建是治疗下颈椎椎体转移瘤的有效方法.     

单纯一期后路病灶清除椎体间植骨融合内固定治疗胸椎结核的临床研究

[目的]评价一期后路病灶清除、椎体间植骨、钉棒系统内固定治疗胸椎结核的临床疗效及可行性.[方法]回顾性分析60例单节段胸椎结核患者,男34例,女26例;平均年龄37.5岁.合并脊髓功能障碍者24例,合并明显脊柱后凸畸形(SI＞15°)者38例.CT或MRI显示所有患者病灶有明显的骨质破坏和不同程度脓肿形成,无巨大脓肿的患者.术前给予2周以上的抗结核化疗.研究观察的指标包括手术情况(手术时间、出血量、卧床时间)、并发症、神经功能的恢复、成角畸形的矫正及植骨融合率等.[结果]所有病例均得到随访,平均随访时间27.5个月.平均手术时间251 min,平均失血量780 ml.后凸畸形矫正率79％,矫正角度平均25°,末次随访矫正角度丢失1.2°.神经功能改善率90.1％.术后3个月内ESR及CRP恢复至正常水平.植骨融合率100％,治愈率为100％.无脊髓功能损伤,无严重并发症发生.[结论]该术式能满意地清除病灶,安全地进行椎体间植骨,脊柱稳定性能得到有效重建,临床效果良好,是一种值得推广的手术方式.     

脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

一期后路SSPI并椎间/椎体植骨治疗胸腰椎爆裂型骨折

目的 评价一期后路经榷弓根短节段内固定(SSPI)并椎间/椎体植骨治疗胸腰椎爆裂型骨折的临床疗效.方法 回顾性分析了2007年3月～2009年10月在该院住院治疗的32例胸腰椎爆裂型骨折患者的临床资料,采用一期后路SSPI并椎间/椎体植骨的手术方式进行治疗,对患者手术前后骨折椎椎体前缘高度、椎管狭窄指数、cobb角度数、胸腰背功能及脊髓神经功能的改善等情况进行比较,观察并评估其临床疗效及骨性融合情况.结果 术后所有患者均获得了随访,随访时间为6～18个月,平均14个月,损伤节段骨性融合率为100％.其中,骨折椎椎体前缘高度从术前的(13.8±4.2)mm恢复至术后末次随访时的(26.4±5.6)mm;后凸角从术前的(23.4±7.2)°恢复至术后末次随访时的(5.5±2.9)°;cobb角度数从术前的(21.3±6.4)°恢复至术后末次随访时的(5.3±2.7)°;椎管狭窄指数全部恢复为0;胸腰背功能(Oswestry功能障碍指数)及神经功能(Frankel脊髓损伤分级)情况均较术前有明显改善,经比较差异有显著性(P＜0.05).结论 一期后路SSPI并椎间/椎体植骨治疗胸腰椎爆裂型骨折,具有操作简单,创伤小,术后并发症少,骨性融合良等特点,是治疗胸腰椎爆裂型骨折的一种有效手术方式.特别是对于不完全性脊髓损伤,更具良好的临床疗效.     

融合至L3的后路TSRH治疗KingⅣ型青少年特发性脊柱侧凸

[目的] 评价融合至k的后路TSRH治疗King Ⅳ型青少年特发性脊柱侧凸的效果。[方法]前瞻性研究分析本院收治的9例King Ⅳ型青少年特发性脊柱侧凸病人，采用后路TSRH矫形、下终椎L3置入两枚椎弓根螺钉、植骨融合的临床资料及治疗结果。[结果] 手术时间平均为150min，矫正率为81．2％，全部病例随访平均23(4～38)个月，最后一次随诊时，矫形丢失率1．1％，腰椎未融合区无代偿性弯曲，无曲轴现象。[结论] 融合至L3的后路TSRH治疗KingⅣ型青少年特发性脊柱凸效果满意，同时，可最大范围的保留腰椎活动度；只要病例选择恰当，该方法是确实有效、可行的。     

大鼠脂肪间充质干细胞的成骨分化

目的:观察大鼠脂肪间充质干细胞经成骨诱导向成骨细胞分化的生物学特性,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2004-07/2006-03在中南大学湘雅医院中心实验室完成主要工作。①取健康SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫,消化法分离出脂肪间充质干细胞,接种入含有体积分数为0.1的新生牛血清的低糖DMEM培养基进行原代培养。②取第3代的脂肪间充质干细胞,用含有体积分数为0.1的新生牛血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基诱导其向成骨细胞分化。③于3,5,7,10,12,14,21d分别采用倒置显微镜观察细胞形态及增殖情况、Gomori改良钙钴法碱性磷酸酶染色、茜素红S钙结节染色和Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色检测脂肪间充质干细胞成骨分化的情况。结果:①脂肪间充质干细胞原代细胞呈成纤维细胞样长梭形外观,传代稳定,细胞形态均一。②经成骨诱导,脂肪间充质干细胞体积增大,呈多角形;成骨诱导14d,Gomori改良钙钴法碱性磷酸酶染色,细胞胞浆内可见浅棕色至棕黑色的颗粒,平均染色阳性率为80%;碱性磷酸酶活性随时间的延长而逐渐增高[3,5,7,10,12,14d依次为(2.43±0.09),(3.60±0.08),(5.01±0.09),(7.75±0.07),(9.59±0.09),(10.94±0.10)μkat/L];成骨诱导21d,钙结节形成明显,茜素红S染色,呈红色结节;成骨诱导7d,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,细胞胞浆呈棕黄色,胞核经苏木精复染为蓝色。结论:大鼠脂肪间充质干细胞经成骨诱导具有成骨细胞的生物学特性,可作为骨组织工程的种子细胞。     

趾皮甲瓣游离移植再造拇指

1980年Marrison首先报道 趾皮甲瓣移植再造拇指成功以来,国内外有关报道很多。我院1988年至1989年应用 趾皮甲瓣游离移植再造拇指3例,经1～2年随诊,再造拇指感觉良好,外形美观,功能满意。现报告如下。 患者,男,18岁,右拇指缺如半年。于半年前被冲床机轧断右拇指,创面行清创植皮愈合。因生活不便,要求入院治疗。检查:右拇指自掌指关节处缺如(图1)。入院后在连续硬膜外和臂丛麻醉下行 趾皮甲瓣游离移植再造拇指。取同侧 趾皮甲瓣,趾胚侧留存舌形皮瓣,趾的创面取髂部皮片植皮复     

两种方法分离新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的比较

目的比较预消化组织块培养法与传统组织块培养法分离的新生大鼠颅骨成骨细胞纯度和活性的差异。方法无菌条件下取新生大鼠颅骨骨片,分传统法和预消化法进行培养。预消化法先以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA预先消化,再按传统组织块培养法培养,观察细胞移出时间,采用Gomori钙钴法对原代细胞及纯化后细胞进行鉴定,对比两种方法获得的成骨细胞纯度。并测定第1、2代成骨细胞培养第10d胞浆内碱性磷酸酶活性。结果预消化法约第3d开始细胞自骨片移出,传统法约第5d开始细胞移出。两种方法分离的原代细胞碱性磷酸酶染色阳性率分别为(87.83±2.34)%以及(82.88±3.14)%,差异有统计学意义(P<0.05)。纯化后成骨细胞染色阳性率分别为(90.71±3.15)%以及(90.17±2.97)%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法获得的第1、2代成骨细胞培养第10d碱性磷酸酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论预消化组织块培养法细胞移出时间早,且所分离的原代细胞中成骨细胞纯度高。经纯化后成骨细胞纯度和活性与传统组织块培养法相似。