利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系，为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA），将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中；利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06；将病毒感染C2C12细胞，并加入嘌呤霉素筛选，将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA，逆转录成cDNA；设计Cas9引物，利用cDNA为模版，PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达，确认慢病毒成功感染C2C12细胞；利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞；将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA，测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比，确认敲除成功的克隆细胞株；诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化，检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达，RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达，Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒；将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因；敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低，成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低，在分化72和96 h组，H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因，稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功；敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化，并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达，PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。

Construction of Lrtm1 gene knockout C2C12 cell line using the CRISPR/Cas9 system