利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA）,将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成cDNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达,PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。     

骨肉瘤细胞中KDM5C与有丝分裂期纺锤体组装检查点关系的研究

目的：探讨赖氨酸特异性去甲基化酶5C（lysine-specific demethylase 5C,KDM5C）在骨肉瘤细胞有丝分裂期的变化及其对有丝分裂期纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint,SAC）的调控。方法：利用细胞周期同步化方法,收集不同骨肉瘤细胞系有丝分裂期各时间节点的细胞样品,利用Western blot检测各时间点KDM5C蛋白质含量的变化及其翻译后修饰与有丝分裂期进程的关系;并用特异性抑制剂CPI-455抑制KDM5C的去甲基化转移酶活性,利用Western blot检测有丝分裂期进程中抑制KDM5C的去甲基化酶活性对SAC相关标志蛋白细胞分裂周期蛋白-27（cell division cycle protein 27,cdc27）、周期蛋白B1（Cyclin B1）的影响。结果：在有丝分裂进程中,与SAC相关的标志蛋白cdc27的磷酸化滞后条带的位移变化和Cyclin B1的蛋白降解均与文献报道相似,但KDM5C蛋白含量无明显变化;KDM5C截短体表达未观察到明显的位移减慢或泛素化降解条带;抑制其去甲基化酶活性后,相较对照组,标志蛋白cdc27的去磷酸化曲线和Cyclin B1降解曲线未见明显变化。结论：在骨肉瘤细胞系有丝分裂期中,KDM5C的蛋白质含量不随有丝分裂期进程而改变,抑制其去甲基化酶活性不影响对SAC的灭活。     

骨肉瘤细胞中H3K79me2，3参与有丝分裂期调控的研究

目的：为了研究组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化和三甲基化（H3K79me2,3）水平在骨肉瘤细胞有丝分裂期的变化及对有丝分裂期进程的影响。方法：利用细胞周期同步化方法,观察骨肉瘤细胞U2OS在有丝分裂期前中期到出有丝分裂期各阶段H3K79me2,3水平的变化;并用特异性抑制剂EPZ5676抑制H3K79甲基化水平,用Western blot及活细胞荧光激光共聚焦检测其对有丝分裂期进程的影响。结果：在骨肉瘤细胞U2OS中,H3K79me2,3水平在有丝分裂期前中期下降,并随着细胞出有丝分裂期,H3K79me2,3水平逐渐增加,使用抑制剂进一步降低其在有丝分裂期的水平并抑制其随后的增加,对有丝分裂期中期到后期的转化过程影响不明显,但会引起姐妹染色单体分离错误出现的比例增高（χ2=4.99,P=0.026）。结论：H3K79me2,3水平在骨肉瘤有丝分裂期前中期降低,并随着细胞出有丝分裂期逐渐升高,这种变化可能与确保姐妹染色单体正确分离的相关调控有关。