奇异变形杆菌单个菌落培养方法的探讨

目的探讨奇异变形杆菌单个菌落培养方法,为菌落计数及其它相关实验打下基础。方法分别用含不同硼酸浓度LB培养基、不同琼脂浓度LB培养基、LSW培养基、ss培养基以及普通LB培养基倾注法对奇异变形杆菌进行培养并计算菌落数。结果 1.5%琼脂LB培养基、ss培养基、0.4%硼酸LB培养基、LSW和倾注法所得的菌落数两两比较差异无统计学意义(P>0.05),0.1%硼酸LB培养基、0.2%硼酸LB培养基、2.5%琼脂LB培养基和3.5%琼脂LB培养基所得菌落数差异无统计学意义(P>0.05),而1.5%琼脂LB培养基、ss培养基、0.4%硼酸LB培养基、LSW和倾注法所得的菌落数低于0.1%硼酸LB培养基、0.2%硼酸LB培养基、2.5%琼脂LB培养基和3.5%琼脂LB培养基所得菌落数,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论根据培养时间、菌落大小及菌落数量,选取含0.1%硼酸LB培养基培养24 h为奇异变形杆菌单个菌落计数方法最佳培养方法 。     

不同浓度硒对变形链球菌生长和代谢影响的实验研究

目的:通过观察不同浓度硒制剂对连续厌氧培养的变形链球菌(S.mutans)生长及产酸情况的影响,观察硒对变形链球菌的作用。方法:将复苏的变形链球菌标准株(Ingbritt C),分别等量接种于含不同浓度硒的TS液体培养基中。采用厌氧菌连续培养技术,通过分光光度计检测菌液OD值,绘制生长曲线,并通过pH仪检测菌液pH值;培养24h终止后,接种于平皿进行菌落(CFU)计数。结果:实验组变形链球菌的生长曲线在生长对数期较对照组低(培养第2~8h),硒浓度0.8ppm组菌液OD值低于其他组(P<0.05);各实验组与阴性对照组菌液pH值无明显差别(P>0.05);硒浓度为0.8ppm组菌落计数低于其他实验组与阴性对照组(P<0.05)。结论:一定浓度的硒(0.8ppm)可使变链菌生长受到抑制。值得注意的是,在该组变链菌数目明显减少的情况下,细菌培养液的pH值与其他组无显著性差异,其原因尚待进一步研究。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖的影响

目的观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)增殖的影响,以探索体外培养HAMSCs的最适条件。方法分离、培养HAMSCs,选取第3代细胞进行鉴定及检测。实验组将bFGF分为0.1、0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml共8个浓度组;阴性对照组只加HAMSCs,不加bFGF;空白对照组只加培养基。各组孵育48h后加入Am-Blue试剂,继续孵育,待培养基由靛青蓝色开始变成粉红色时取出用酶标仪测量各组的吸光度(OD),重复3次实验。结果 0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml浓度组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与0.5、1、5ng/ml组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与40、80ng/ml组相比,差异无统计学意义(P=0.067),表明bFGF促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。结论 bFGF能够促进HAMSCs增殖,且促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。     

金芪降糖片对2型糖尿病前期的干预试验

目的考察金芪降糖片对2型糖尿病前期患者血糖及血脂的药理作用。方法84例2型糖尿病前期患者随机分为观察组和对照组,每组42例。2组患者均给予饮食控制、戒烟戒酒、体育锻炼等健康教育。在此基础上观察组给予金芪降糖片3.36 mg,饭前30 min口服,每日3次,共12周;对照组给予二甲双胍500 mg,每日3次,共12周。观察2组患者血糖、血脂各项指标在治疗前后的变化。结果观察组和对照组患者的空腹血糖及葡萄糖耐量试验(OGTT)2 h血糖在治疗6周和12周后与治疗前相比,差别均有统计学意义(P<0.05);2组患者之间空腹血糖及OGTT 2 h血糖在治疗6周和12周后比较差别无统计学意义(P>0.05)。治疗12周后,观察组胆固醇及甘油三酯低于治疗前,差别有统计学意义(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇高于治疗前,差别有统计学意义(P<0.05);对照组各指标与治疗前比较无明显变化,差别无统计学意义(P>0.05)。治疗12周后观察组甘油三酯低于对照组,高密度脂蛋白胆固醇高于对照组,差别均有统计学意义(P<0.05)。2组均未出现严重不良反应。结论金芪降糖片对于2型糖尿病前期疗效显著,尤其适合于糖尿病前期合并高脂血症的患者。     

右心室心尖部起搏自动睡眠功能开放对左心功能的临床观察

目的:前瞻性观察单腔起搏器自动睡眠功能开放对左心功能的影响并探讨可能机制。方法:24例Ⅲ度房室传导阻滞经锁骨下静脉途径成功置入永久单腔心脏起搏器(VVI),随机分为自动睡眠功能打开组(n=12)及对照组(未开放,n=12),分别在植入后出院前,1年时随访,测定总心搏数及心房颤动(AF)发生率,右室起搏比率,左室舒张末内径(LVEDD),左室射血分数(LVEF)。结果:两组的右室起搏比率比较,差异无统计学意义;两组在刚植入时24h总心搏数的比较差异无统计学意义(P>0.05);1年时总心搏数比较差异有统计学意义(P<0.0001);两组AF发生率在刚植入时差异无统计学意义(P>0.05),对照组出院前与1年时差异有统计学意义(P<0.05);打开组LVEDD及LVEF变化差异无统计学意义(P>0.05);对照组LVEDD及LVEF变化差异有统计学意义(P<0.05)。结论:睡眠功能开放可减少右室起搏数量,延缓左室扩大,减少心功能下降。     

高浓度葡萄糖上调人血管内皮细胞水孔蛋白-1的表达

目的 观察高浓度葡萄糖对人血管内皮细胞水孔蛋白-1(AQP1)表达的影响。方法 用高浓度葡萄糖和高渗透压分别刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)6、24、48、72 h,观察其对AQP1蛋白和mRNA表达的影响,以未添加葡萄糖或甘露醇培养组为对照组。结果 培养6 h后,各组AQP1蛋白和mRNA的表达量无明显差别(P>0.05);培养24 h后,4.25％葡萄糖组与对照组相比,AQP1表达量明显增加(P<0.05);继续培养AQP1表达量的增加更为明显。与甘露醇培养基组比较,AQP1表达量在蛋白质水平和mRNA水平均无明显差别(P>0.05)。结论 提示体外高浓度葡萄糖可上凋人血管内皮细胞AQP1的表达,其上凋作用可能主要通过高渗透压作用介导。     

空调送风中细菌总数和真菌总数的检测方法

目的比较空调送风中细菌和真菌在不同培养基上的生长情况及培养时间的影响,探讨空调送风中的细菌总数和真菌总数检测方法。方法随机采集珠三角某市26套公共场所空调系统送风中的空气样品126份,分别检测细菌总数和真菌总数,细菌总数检测分别采集样品在营养琼脂平板和血琼脂平板,35~37℃培养48 h,计数细菌菌落数;真菌总数采集样品在沙氏琼脂平板经28℃培养1~7 d,每天观察并记录结果。采用SPSS13.0统计软件对结果进行统计分析。结果营养琼脂平板和血琼脂平板细菌菌落数差异无统计学意义(t=1.35,P0.05);真菌总数检测培养3、4、5 d均数之间的差异无统计学意义(P0.05);真菌菌量最多的培养时间为3 d(占30.95%);真菌菌落蔓延满平板最多的培养时间为4 d(占蔓延满平板数的37%)。结论空调送风中细菌总数检测在营养琼脂平板和血琼脂平板均适用,真菌菌落总数检测的最佳计数时间为培养3 d。     

VEGF-C治疗继发性肢体淋巴水肿的实验研究

目的研究VEGF-C对继发性肢体淋巴水肿的治疗效果。方法手术和放射相结合的方法制作兔后肢淋巴水肿模型,之后将VEGF-C注射到局部水肿软组织中,对照组注射生理盐水。结果肢体水肿体积比较:治疗后同一时间两组比较均为P<0.05,差别有统计学意义;同组内不同时间比较,观察组均为P<0.05,差别有统计学意义;对照组均为P>0.05,差别无统计学意义。微淋巴管计数:治疗后同一时间两组比较,均为P<0.01,差别有明显统计学意义;同组内不同时间比较,均为P<0.01,差别有明显统计学意义。Flt-4、VEGF-C及vWF蛋白的变化:两组间比较,VEGF-C/β-actin,P<0.01,差别有显著统计学意义;FLT-4/β-actin,P<0.01,差别有显著统计学意义;vWF/β-actin,P>0.05,差别无统计学意义。结论重组VEGF-C蛋白局部注射后,水肿组织中VEGF-C、FLT-4等维持较高水平,促进淋巴管内皮细胞增生,加快淋巴回流网络的重建,可明显减少肢体水肿体积,并且随时间延长疗效逐渐增强,是治疗继发性肢体淋巴水肿的有效方法。     

瘦素对体外培养软骨细胞分泌NO和MMP-13的影响

目的:观察瘦素对体外培养兔关节软骨细胞分泌一氧化氮(NO)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的影响。方法:获取2月龄兔原代软骨细胞,培养、鉴定、传代。将第3代软骨细胞按实验要求种板培养,饥饿12 h后,以不同浓度瘦素单独或与 TNF-&agr;联合干预48或96 h,测定各组细胞上清液中NO及MMP-13的浓度。结果:不同浓度瘦素(5,10,15和20 μg/mL)组NO浓度与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05);而不同浓度的瘦素与TNF-&agr;(10 ng/mL)联合应用后,与TNF-&agr;组差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组并未测出MMP-13的存在,不同瘦素浓度(10,50和100 ng/mL)组测得MMP-13浓度在剂量主效应和时间主效应均有统计学意义(P<0.05)。结论:瘦素在体外能协同TNF-&agr;促进兔关节软骨细胞分泌NO和MMP-13。     

瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响

目的观察瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响。方法分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠肝脏细胞,与瘦素共同孵育12 h、24 h及36 h,提取蛋白后用Western blot法检测瘦素受体的蛋白水平的变化,用RT-PCR法检测大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA水平,用免疫共沉淀法检测瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度。结果大鼠肝细胞的瘦素受体的蛋白水平在与瘦素共同孵育12 h、24 h和36 h后与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达在孵育12 h后与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),孵育24 h及36 h后,与对照组及孵育12 h时相比,mRNA水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。经瘦素作用12 h后,对大鼠肝脏细胞瘦素受体酪氨酸磷酸化无显著影响(P>0.05),但孵育24 h及36 h后,大鼠肝脏细胞瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度与对照组及瘦素作用12 h后相比均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论瘦素可促进大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达并增强其酪氨酸磷酸化程度。     

蜕皮甾酮对人表皮干细胞体外增殖的影响

目的观察蜕皮甾酮(EDS)对人表皮干细胞(hESCs)体外增殖的影响。方法采用中性蛋白酶-Ⅳ型胶原黏附法分离正常人包皮表皮干细胞,免疫细胞化学法检测第3代细胞β1整合素、角蛋白19(CK19)、角蛋白14(CK14)及角蛋白10(CK10)的表达以鉴定hESCs。分别用含0 mg.L-1(对照组)、10 mg.L-1(10 mg.L-1组)、20 mg.L-1(20 mg.L-1组)、40 mg.L-1(40 mg.L-1组)、80 mg.L-1(80 mg.L-1组)及160 mg.L-1(160 mg.L-1组)EDS的Ep ilife培养基作用第3代hESCs 3 d,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测酶标仪490 nm下的吸光度值,评价EDS对hESCs体外增殖的影响。结果免疫细胞化学法检测提示第3代表皮干细胞β1整合素、CK 19、CK 14的表达阳性,CK 10表达阴性。EDS作用3 d后,10 mg.L-1组、20 mg.L-1组、40 mg.L-1组、80 mg.L-1组及160 mg.L-1组吸光度均高于对照组(P<0.05);40 mg.L-1组、80 mg.L-1组和160 mg.L-1组吸光度均高于10 mg.L-1组和20 mg.L-1组(P<0.05);80 mg.L-1组吸光度高于40 mg.L-1组和160 mg.L-1组(P<0.05);其余各组间两两比较无统计学差异(P>0.05)。结论体外培养条件下EDS能促进hESCs增殖,该作用在EDS浓度为80 mg.L-1时最为显著。     

关于抑制急性坏死性胰腺炎细菌移位的实验研究

目的：探讨利用不同方法抑制急性坏死性胰腺炎细菌移位的效果。方法：将60只SD大鼠分为对照组、ANP（急性坏死性胰腺炎）组、参附注射液组以及清胰利胆颗粒组,每组15只。利用牛磺胆酸钠制作SD大鼠的ANP模型,参附注射液组给予参附注射液进行治疗,清胰利胆颗粒组使用清胰利胆颗粒进行治疗,对照组与ANP组给予相同剂量的生理盐水。治疗结束后取大鼠的肠系膜淋巴结、腹水与下腔静脉血培养,对比四组大鼠各个部位的病原菌落计数。结果：对照组的各部位病原菌落计数要明显低于ANP组、参附注射液组与清胰利胆颗粒组（P〈0．01）;参附注射液组与清胰利胆颗粒组的各部位病原菌落计数要明显低于ANP组（P〈0．01）;参附注射液组与清胰利胆颗粒组的各部位病原菌落计数差异无统计学意义（P〉0．05）。结论;参附注射液与清胰利胆颗粒可以有效地抑制急性坏死性胰腺炎的细菌移位。     

葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞VEGF mRNA表达的影响

目的研究不同浓度的葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达的影响。方法体外常规培养4T1肿瘤细胞,根据细胞培养液RPMI1640培养基中所含葡萄糖和胰岛素浓度的不同将4T1肿瘤细胞分为15组。每组设双复孔,置于37℃、5％C02的细胞培养箱培养,48h后收集细胞,提取总RNA,RT—PCR同时扩增目的片段VEGF和内参照B—actin,琼脂糖凝胶电泳,扩增产物在凝胶成像系统上扫描分析,计算VEGFmRNA相对表达量。整个实验过程重复3次。结果培养液中含有不同浓度葡萄糖的B、c、D、E组VEGFmRNA的表达与A组相比变化不明显（P〉0．05）。F组、G组和J组VEGFmRNA的表达与A组相比差异均无统计学意义（P〉0．05）;在含有高浓度胰岛素的H组、I组VEGFmRNA的表达水平与A组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。L组和M组的VEGFmRNA的表达水平与A组相比差异有统计学意义（P〈0．05）;而K组、N组和O组与A组相比差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论高浓度的胰岛素能够使4T1肿瘤细胞VEGFmRNA的表达上调,葡萄糖浓度的变化对4T1肿瘤细胞VEGFmRNA的表达无明显影响。     

不同培养基对血液透析用水细菌菌落检测比较

目的比较各种培养基在不同培养温度和时间条件下对血液透析用水的细菌检出率,探索临床上合适的透析用水细菌菌落检测方法。方法2012年1—12月随机采集上海交通大学医学院附属仁济医院血液净化中心透析用水样本共152份。分别接种在血培养基、胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）、Reasoner’2A琼脂（R2A）和胰蛋白胨葡萄糖浸膏琼脂（TGEA）的4种培养基,分别在20℃、30℃和35℃培养48～168h。培养结束时对每个培养皿进行细菌菌落计数。结果血培养基组透析用水细菌菌落计数和细菌检出率最低,与TGEA和R2A相比差异具有统计学意义（P〈0．05和P〈0．01）。R2A在20℃环境下培养168h,细菌检出率较血培养35℃培养48h显著增加（67．1％vs43．4％,P〈0．01）。Bland．Ahman分析显示,R2A培养基20℃培养168h与TGEA培养基30℃培养120h两组细菌检出率具有较好的一致性。结论使用R2A或TGEA培养基较血培养基显著提高透析用水细菌菌落计数和细菌检出率。临床上适合选用R2A培养基20℃、168h或TGEA培养基30℃、120h方法对血液透析用水进行细菌菌落检测。     

白蛋白对肾小管上皮细胞增殖的影响

目的探讨蛋白尿检在不同时间点对大鼠近端。肾小管上皮细胞增值的影响。方法观察组采用体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞（Rat proximal renal tubular epithelial cells,NRK-52E）,取生长状态良好,待其接近融合时模拟体内大量蛋白尿环境,给予不同浓度（10、20、30mg·ml^-1）去脂牛血清白蛋白（fat free bovine serum albumin,BSA）刺激,共同孵育6、12、18、24h;对照组给予同体积无血清培养基共同培养。采用MTT试验检测BSA对体外培养NRK-52E细胞毒作用。结果与对照组比较,白蛋白浓度为10mg·ml^-1时对NRK-52E细胞分别作用6、12、18和24h后,对细胞增殖程度影响没有差异（P〉0．05）。当白蛋白浓度为20mg·ml^-1时,对NRK-52E细胞作用6h后,细胞增殖程度与对照组比较没有差异（P〉0．05）,但随着作用时间的延长,细胞增殖低于对照组（P〈0．05）。当白蛋白浓度为30mg·ml^-1时,随着作用时间的延长细胞增殖几乎停滞,与对照组比较有统计学差异（P〈0．05）。结论白蛋白以时间和剂量依赖方式抑制NRK-52E细胞增殖,并可促进肾小管上皮细胞凋亡。     

2型糖尿病大鼠骨髓干细胞条件培养基促进糖尿病大鼠脑梗死后神经功能恢复

目的 探讨2型糖尿病（T2DM）大鼠骨髓干细胞条件培养基（BMSC-CM）对T2DM大鼠脑缺血/再灌注损伤后神经功能恢复的影响.方法 将成年雄性SD大鼠用烟酰胺、链脲佐菌素（STZ）诱导制作T2DM模型,制备T2DM大鼠BMSC-CM,线栓法制作T2DM大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）脑缺血/再灌注模型.实验动物分为空白对照组、单纯培养基组和条件培养基治疗组（每组n=6）.治疗组分别于术后24、48 h经尾静脉注射T2DM大鼠BMSC-CM（10 ml/kg）,单纯培养基组经尾静脉注射培养基DMEM,空白对照组未给予任何干预措施.术后1、7、14天分别进行神经功能缺损评分（mNSS）和足错步试验.结果 术后第1天,各组mNSS、足错步次数比较差异无统计学意义（P＞0.05）.术后第7、14天,条件培养基治疗组mNSS、足错步次数明显低于空白对照组和单纯培养基组（P＜0.05）,空白对照组与单纯培养基组mNSS、足错步次数差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 T2DM大鼠BMSC-CM可明显促进T2DM大鼠脑梗死后的神经功能恢复.     

全身麻醉和硬膜外麻醉对老年患者术后短期认知功能的影响

目的：探讨全身麻醉和硬膜外麻醉对老年患者术后短期认知功能的影响。方法：选择拟行外科手术治疗老年患者120例,随机分为观察组和对照组,每组60例。观察组患者采取硬膜外麻醉方法,对照组采取全身麻醉方法。记录两组患者麻醉前、术后6h、24h、72h和5d的蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分,并比较两组患者术后认知功能障碍（POCD）发生率。结果：两组患者术后6h、24h和72h的MoCA评分比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,术后5d的MoCA评分比较差异无统计学意义（P〉0.05）;观察组患者术后6h和24h的MoCA评分均低于麻醉前,差异有统计学意义（P〈0.05）,术后72h和5d的MoCA评分与麻醉前比较差异无统计学意义（P〉0.05）;对照组患者术后6h、24h和72h的MoCA评分均低于麻醉前,差异有统计学意义（P〈0.05）,术后5d的MoCA评分与麻醉前比较差异无统计学意义（P〉0.05）;两组患者术后6h、24h和72h的POCD发生率比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,术后5d的POCD发生率比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：硬膜外麻醉对老年患者术后短期认知功能影响较全身麻醉轻,POCD发生率低,值得临床进一步研究。     

虫草素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响

目的观察虫草素对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的离体大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和syndecan-4蛋白表达的影响。方法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,分别应用终浓度为20 ng/mL TNF-α、20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNF-α＋20μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNF-α＋40μmol/mL虫草素作用24 h,并设对照组进行比较。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中syndecan-4蛋白的表达。结果（1）与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖（P〈0.05）,而虫草素不同剂量组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无明显作用（P〉0.05）。TNF-α联合虫草素共同作用组与TNF-α组比较,VSMCs增殖均显著减少（P〈0.05）。（2）Western blot蛋白免疫印迹法测定显示：与对照组比较,TNF-α组能显著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表达（P〈0.05）,而虫草素不同剂量组单独应用对V...更多SMCs的syndecan-4蛋白表达均无明显影响（P〉0.05）。TNF-α联合虫草素共同作用组与TNF-α组比较,VSMCs的syndecan-4蛋白表达显著降低（P〈0.05）。结论虫草素可明显抑制TNF-α诱导的VSMCs增殖及细胞syndecan-4蛋白的表达。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶的影响

目的研究低氧状态下乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynu—cleotide,AS—ODN）对胰腺癌高转移细胞株MIAPaCa-2细胞基质金属蛋白酶．2（matrixmetalloproteinase．2,MMP-2）和MMP-9的影响。方法以HpaAS—ODN预先阻断MIAPaCa-2细胞Hpa表达并低氧培养,观察MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达的变化,明胶酶法检测MMP-2和MMP-9活性的变化,观察阻断Hpa对MMP-2和MMP-9表达及活性的影响。结果低氧培养条件下,MIAPaCa-2细胞MMP-2mRNA及蛋白表达略有上调,但是与常氧条件下培养对比,在6、12和24h差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。以ASODN阻断Hpa后,MMP-2mRNA及蛋白表达均无明显变化。低氧后6hMMP-9mRNA及蛋白表达开始升高,12h（P〈0．05）和24h（P〈0．01）更加明显。阻断Hpa表达后,MMP-9mRNA及蛋白表达在各时间段均有下降,而在24h下降明显,差异具有统计学意义（P〈0．01）。低氧后12h和24h,活化型的MMP-2和MMP-9均显著增强,当Hpa表达被抑制后,于12h（P〈0．01）和24h（P〈0．01）活化型的MMP-9活性受到明显抑制,而各时间内,活化型的MMP-2活性均不受HpaAS—ODN的影响（P〉0．05）。结论低氧可刺激MIAPaCa-2细胞MMP-9mRNA及蛋白的表达,增强酶活性。预先阻断Hpa表达在12h和24h可抑制MMP-9mRNA和蛋白的表达,降低MMP-9的活性,而对MMP-2则无明显影响。     

酶联合消化法分离犬心房肌成纤维细胞及其生物学特性的研究

目的探讨适用于犬心房肌成纤维细胞(CAF)体外分离培养及鉴定的技术方法。方法无菌手术取犬左心耳,应用木瓜蛋白酶、Ⅰ型胶原酶联合消化法分离心房肌成纤维细胞并进行体外培养。在倒置显微镜下观察原代心房肌成纤维细胞生长特点;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态,并对细胞进行纤维连接蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2蛋白免疫荧光染色;通过绘制生长曲线法、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2-四唑单钠盐(WST-8)法观察细胞的增殖情况;流式细胞仪分析比较各代细胞DNA周期特点;观察不同培养体系对第3代(P3)CAF生长的影响。结果酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形,7 d后细胞排列成单层,连接紧密;HE染色显示细胞长梭形呈螺旋状排列;免疫荧光检测纤连蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2表达阳性;P1、P2、P3细胞生长曲线近似"S"形,WST-8法显示P1、P2、P3细胞生长于第3天至第5天光密度值变化较明显,增殖迅速;P1、P2、P3G0/G1的百分率分别为(56.83±1.72)%、(68.10±1.33)%、(68.23±1.33)%,各代之间G0/G1的百分率比较差异无统计学意义(P>0.05);P1、P2、P3(S+G2)/M的百分率分别为(43.17±1.72)%、(31.90±1.33)%、(31.77±1.33)%,各代之间(S+G2)/M的百分率比较差异无统计学意义(P>0.05);杜尔伯克改良伊格尔/F12培养基培养的P3细胞增殖力明显高于RPMI-1640培养基培养的细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶联合消化法可以高效快速分离和稳定培养CAF,为研究犬心房纤维化提供了充足的种子细胞。