细胞穿膜肽-抗人膀胱癌单克隆抗体-载丝裂霉素白蛋白纳米微球三联体的靶向性和穿膜活性研究

目的：探讨细胞穿膜肽（TAT-EGFP）一抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）一载丝裂霉素白蛋白纳米微球（MMC-NS）三联体的靶向性和穿膜活性。方法：采用异型双功能连接剂SPDP,偶联TAT-EGFP、BDI-1、MMC-NS形成三联体偶联物,进行EJ人膀胱癌靶向结合及穿膜试验,通过激光共聚焦、扫描电子显微镜及透射电子显微镜检测其靶向结合特异性和穿膜活性。结果：成功地应用异型双功能连接剂SPDP偶联TAT-EGFP、BDI-1、载MMC白蛋白纳米微球制成三联体。TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS偶联物能够成功进入细胞发挥细胞毒作用。首次发现TAT-EGFP内化MMC-NS入EJ人膀胱癌细胞内部后微绒毛消失的现象。结论：TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三联体有可能应用于膀胱肿瘤的靶向治疗。     

Matrigel穿膜侵袭实验技术改进

侵袭和转移是恶性肿瘤最显的特征，Matrigel穿膜侵袭实验是研究肿瘤细胞在体外侵袭能力的常用实验之一，经常使用Boyden小室体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭潜能。但是在实验中常常并不能获得理想的结果，其原因是没有掌握实验的具体操作细节。我们经过反复的实践，通过技术改进，取得了较好的效果。     

细胞穿膜肽药物载体研究进展

细胞穿膜肽(CPP)是一类具有穿透细胞膜功能的小分子多肽,能携带多种生物活性分子进入细胞。随着对CPP研究的深入,发现其存在抗蛋白酶水解稳定性差、内体逃逸率低和缺乏靶向性等问题,严重限制其作为药物载体的应用。为了克服这些问题,完善CPP的药物载体功能,广大研究者提出了许多改进策略。本文主要就其改进策略加以综述,以期为CPP的改进提供新的思路。     

细胞穿膜肽的治疗应用

细胞穿膜肽(CPPs)是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,能将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入哺乳动物细胞内,其转导效率高且不会造成细胞损伤。CPPs的具体穿膜机制尚不清楚,甚至互相矛盾,但并不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用。CPPs已经在肿瘤、心肌病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景。     

穿膜肽TAT-p38αG融合基因的构建、表达及穿膜特性的鉴定

目的 构建穿膜肽TAT-p38αG融合基因,进行原核表达及穿膜特性鉴定.方法 提取人EVC304细胞总RNA,巢式PCR扩增p38αG基因片段,T-A克隆,测序证实片段无误后,将p38αG基因片段亚克隆入原核表达载体pTAT-HA,获得pTAT-p38αG融合基因表达载体.将表达载体转化大肠杆菌,IPTG诱导表达获得TAT-p38αG融合蛋白,并行Ni-NTA柱过柱和超滤纯化,抗His抗体免疫印迹法鉴定.采用荧光素FITC体外标记TAT-p38αG融合蛋白,与EVC304细胞共培养,荧光显微镜下观察其穿膜特性.结果 成功构建了融合基因原核表达载体pTAT-p38αG,并表达出大小约30×103的蛋白产物,与融合蛋白TAT-p38αG理论计算值相符.细胞实验结果显示,TAT-p38αG能呈浓度依赖性方式转导进入EVC304细胞.结论 TAT-p38αG融合蛋白具有良好的穿膜特性,研究为下一步鉴定TAT-p38αG融合蛋白对p38α激酶的抑制作用奠定了良好的实验基础.     

硬脊膜穿破39例处理体会

硬脊膜穿破是硬膜外阻滞麻醉中最常见的意外，其发生率为0．27～0．6％^[1]。硬脊膜穿破后并发症较多。现将我院过去5年非脊柱型手术硬脊膜穿破39例总结报道如下：     

MPP-hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP-hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性.在分析MPPs家族分子组成特点的基础上,合成了PLNG活性肽.并且应用重组技术构建了MPP-hPER1融合蛋白表达体系,通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段,观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下,PLNG及MPP-hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力.结果显示PLNG及MPP-hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型.提示生物体中有一类特殊的生物大分子,按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用.实验结果提示,PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体,介导功能分子进入细胞,在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用.     

细胞穿膜肽的研究进展与前景展望

细胞穿膜肽（CPPs）是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽．能携带大分子生物活性物质进入哺乳动物细胞。既不影响转导物质的生物活性且不会损伤细胞,其具体穿膜机制尚在研究,但并不影响其在生命科学研究领域中的应用。在穿膜肽研究的基础上,人们发现了包括肿瘤归巢肽,线粒体穿透肽,可活化细胞穿膜肽．嵌合肽,抗微生物肽等具有高效穿膜活性多肽片段,其作用更加广泛,他们给药物载体研究带来了机遇。然而,由于CPPs作为药物载体的应用过于复杂和难于控制,存在靶细胞摄取效率低及体内吸收、分布、生物利用度和毒性等方面问题,给其进一步研究和应用带来挑战。     

TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定

目的 表达并纯化TAT-N24穿膜融合多肽,初步探讨其生物学活性.方法 构建pTAT-HA-N24原核表达载体,在BL21大肠埃希菌中表达并纯化TAT-N24融合多肽,利用SDS凝胶电泳检测纯化蛋白的纯度,利用免疫细胞化学和流式细胞术检测TAT-N24融合蛋白的穿膜能力和生物学活性.结果 在原核表达系统中成功构建并表达纯化了TAT-N24穿膜融合多肽,其在6 mol/L尿素和DMSO中均具有较好的溶解性,纯化的融合多肽经SDS凝胶电泳分析未见明显杂蛋白混入,利用免疫细胞化学染色可见TAT-N24处理结肠HT29细胞12 h后90%以上的细胞中可检测到TAT-N24,流式细胞术检测细胞周期可见TAT-N24能够有效地诱导细胞周期阻滞,抑制结肠癌细胞生长.结论 TAT-N24具有高效的穿膜能力,并能有效抑制结肠癌细胞增殖,可望开发成为有效的肿瘤分子治疗药物.     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

目的 构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内.结果 TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白.结论 构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础.     

细胞穿膜肽在抗肿瘤靶向治疗中的研究进展

随着生物技术的发展,生物大分子在疾病治疗中的作用愈加重要,如蛋白质、寡核苷酸、多肽等.但是由于细胞膜的天然屏障作用,这些生物大分子的实际应用受到限制.细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类具有较强细胞膜穿透能力的小分子短肽,可携带多种大分子物质进入细胞.本文综述了作为纳米载体的CPPs的分类及跨膜机制,以及近年其在抗肿瘤靶向治疗中的研究进展.     

环甲膜穿剌置管的临床应用

<正> 环甲膜穿刺置管给药在呼吸内科应用效果很好。现将穿刺及应用方法介绍如下:操作方法:患者取仰卧正中位,颈部充分伸展。在甲状软骨下方之环甲膜处(环甲膜又叫弹性园锥),常规皮肤消毒。左手拇、食指将皮肤固定,右手持穿     

周边囊膜穿刺破囊法治疗囊膜破损的外伤性白内障15例

外伤性白内障是眼外伤的主要并发症 ,约占 36 %～ 52 .9% [1] 。眼球穿通伤所致的外伤性白内障 ,常有晶体前后囊膜的破损。本文观察了 15例囊膜破损的外伤性白内障 ,采用周边囊膜穿刺破囊法抽吸晶体皮质 ,并借助残留的囊膜植入后房型人工晶体。术中及术后无明显并发症 ,术后视力恢复满意。1　资料与方法1 1　一般资料本组 15例外伤性白内障 ,术前均发现囊膜破损 ,均为男性 ,年龄 4～ 33岁 ,平均 2 0岁 ,均为眼球穿通伤所致外伤性白内障。1.2　手术方法成人按白内障常规局麻 ,幼儿采用全麻加局麻。角膜清创缝合术及白内障切口按常规 ,于周边…     

一种合成多肽——PLNG自由穿膜现象初探

目的 研究人工设计合成的多肽PLNG在不同作用环境条件下的跨膜运动现象。方法 体外培养不同组织来源的鼠细胞及CHO细胞、BEL细胞,用免疫荧光观察不同浓度、不同温度、不同反应时间条件下,PLNG的穿膜能力及PLNG对不同类型的细胞（CHO细胞、BEL细胞、成年大鼠肝细胞、幼大鼠肝细胞、成年大鼠心肌细胞、幼大鼠心肌细胞、成年大鼠神经细胞、幼大鼠神经细胞）的穿膜特性。结果 PLNG在不同作用环境条件下对细胞膜都有穿透作用,且进入细胞的量近乎相同。结论 实验观察到PLNG具有广谱的穿膜能力,这种穿膜能力在一定范围内对温度、时间及PLNG浓度不敏感;而且这种穿膜能力不受组织特异性的限制。     

MPP—hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP－hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性。在分析MPPs家族分子组成特点的基础上，合成了PLNG活性肽。并且应用重组技术构建了MPP－hPER1融合蛋白表达体系，通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段，观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下，PLNG及MPP－hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力。结果显示：PLNG及MPP－hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型。提示生物体中有一类特殊的生物大分子，按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用。实验结果提示，PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体，介导功能分子进入细胞，在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用。     

环甲膜穿剌逆行引导气管插管的体会

<正> 在全麻插管实践中,插管困难者不少,其中插管特别困难者偶有发生。我院自1987年以来,有4例插管特别困难,在一般快插失败后,再行环甲膜穿刺逆行引导气管插管获得成功,现总结如下。临床资料本组4例,均为男性,年龄36—68岁,ASA 分级:2例Ⅰ级,2例Ⅳ级,神经外科手术2例,食道癌手术1例,肺叶切除术1例。麻醉前用药:常规使用阿托品0.5mg、鲁米那钠0.1g 肌肉注射。麻醉前及插管:本组4例均在常规静脉快诱下行气管插管,继给氟芬合剂。在快插未成功后,采用环甲膜穿刺逆行引导气管插     

新型穿膜肽作为基因运输载体的实验研究

目的 人工设计合成穿膜肽新序列(CGRLWMRWYSPWARRYGC),并于体外考察其作为基因载体的潜力.方法 采用Na_芴甲氧羰基(Fmoc)法固相合成穿膜肽新序列,并用异硫氰酸荧光素(Frrc)标记N端.高效液相色谱及质谱仪检测其纯度及相对分子质量,流式细胞仪及共聚焦显微镜观察其穿膜能力,荧光显微镜和流式细胞仪...