siRNA介导的PD-L1 沉默可增强人CD8+T淋巴细胞的体外杀伤作用

目的设计并筛选多条可高效特异性降低肿瘤细胞表面沉默程序性死亡受体-配体1（PD-L1）表达的小干扰RNA（siRNA） 序列,并研究其增强人CD8+T淋巴细胞对人胶质瘤细胞（U87 MG）免疫杀伤作用。方法根据siRNA设计法则,并通过siDirect 软件在线设计针对PD-L1基因的几种不同的siRNA序列,并运用BLAST进行同源性分析,最终确定候选序列;通过RT-qPCR、 Western blot及流式细胞术实验,选出高效抑制PD-L1 mRNA及蛋白表达的siRNA序列;通过流式细胞术及CCK8检测PD-L1 siRNA沉默U87 MG细胞的PD-L1后,人CD8+T细胞对U87 MG的细胞凋亡及增殖的影响。结果设计了10条针对人PD-L1基 因具有不同核苷酸序列的siRNA。采用RT-qPCR、Western blot及流式细胞术在mRNA及蛋白水平上检测siRNA的沉默效率, 与对照组相比,siPD-L1-1、siPD-L1-2 、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著降低U87 MG 中PD-L1基因的表达 （P<0.05）,其中siPD-L1-3的沉默效率最高。与对照组相比,流式细胞术及CCK8结果显示,siPD-L1-3及siPD-L1-8均可显著增 强人CD8+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用,且该杀伤作用可显著抑制U87 MG细胞增殖（P<0.05）。结论本文设计并筛选了 能有效沉默PD-L1基因表达的siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8的6条序列,其中siPD-L1-3 和siPD-L1-8 可高效增强T 淋巴细胞对U87 MG细胞免疫杀伤作用,且siPD-L1-3 的作用最为显著。本文设计的PD-L1 siRNA分子可以用于设计和制备预防、治疗多种癌症的核酸药物。     

RNA干扰阻断受者树突状细胞表面CD80/CD86通过诱导T细胞凋亡调控T细胞低反应

Background Despite extensive research, the mechanisms of immature dendritic cells (DCs) induced immune hyporesponsiveness remain incomplete. Methods Recipient DCs from C3H mouse bone marrow cells were incubated with donor antigen from splenic lymphocyte of C57BL/6 mouse, these DCs were transfected with CD80/86 specific siRNA using lentiviral vectors. Flow cytometry was used to evaluate expression of CD80/86 on the antigen-pulsed recipient DCs. Immune regulatory activity was examined by mixed lymphocyte reaction, in which irradiated DCs were cultured with C3H spleen T cells. After the reaction, IL-2, IL-4, IL-10 and INF-γ levels of mixed lymphocyte reaction culture supernatant were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The apoptotic T lymphocytes were identified by Annexin V and CD3 staining. Results There was a significant inhibition of CD80/86 expression in DCs transfected with CD80/86 lentiviral vectors compared with the control groups (P <0.05), indicating the specificity of RNA interference. Enzyme-linked immunosorbent assay results showed a significant reduction of INF-γ, IL-2 and IL-10 in the CD80/86 lentivirus transfected group compared to the control groups (P <0.05). There was no significant difference in IL-4 levels between the groups (P >0.05). We also showed that CD80/86 low DCs loaded with alloantigen 1) stimulated low T cell proliferative responses via the indirect recognition pathway and 2) enhanced apoptotic activity (P <0.05) in co-cultured T cells. Conclusions Lentiviral vector transfection can effectively and specifically knock down target genes in DCs. The CD80/86 low DCs may show tolerogenic activity via induction of T-cell apoptosis, thereby modulating activity of recipient-derived DCs. The use of this approach may potentially be clinically applicable.     

In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells

Background  Objective evaluation of the antitumor effect of interleukin-12 (IL-12) gene-transfected dendritic cell (DC) vaccine on laryngeal carcinoma requires in vivo and in vitro tests. The aim of this study was to investigate the function of IL-12 gene transfected DC at initiating specific immune response to laryngeal carcinoma in vitro．

Methods  Recombinant adenovirus with IL-12 gene was constructed. DCs were isolated from the peripheral blood of patients with laryngeal carcinoma, pulsed with tumor lysate of laryngeal carcinoma cells (DC⁺Ag), and transfected with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag). The cells pheotypes including CD83, CD86 and HLA-DR on surface of DCs were assayed by flow cytometry (FCM). The concentration of IL-12 in culture supernatant of DCs and interferon γ (IFN-γ) in culture supernatant of T cells cocultured with DCs were quantified by ELISA. Methyl thiazolys tetrazolium (MTT) was used to evaluate proliferation of autologous T lymphocytes and activation of cytotoxic T lymphocytes (CTL) stimulated by IL-12-transfected DCs pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells.

Results  The recombinant adenovirus expressing IL-12 gene was constructed successfully. Gene-transfected DC plused with tumor lysate with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag) expressed higher level of CD83, CD86 and produced higher level of IL-12 than untransfected DCs (DC⁺Ag) (CD83: (60.2±1.8)% vs. (50.7±1.2)%, P <0.05; CD86: (88.9±2.1)% vs. (78.2±3.9)%, P <0.05; IL-12: (262.5±3.0) ng/L vs. (103.8±5.1) ng/L, P <0.05). The proliferation of autologous T lymphocytes and production of IFN-γ stimulated by DC transfected with IL-12 were more obviously than untransfected DCs. Cytotoxicity of CTL stimulated by IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells were significantly stronger than stimulated by untransfected DC.

Conclusion  It is a promising approach for IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate to increase the antitumoral effect.

     

结肠癌细胞总RNA电穿孔法体外转染成熟树突状细胞

目的：探讨结肠癌细胞总RNA电穿孔法转染成熟树突状细胞（mDCs）的转染效率及对树突状细胞(DCs）特征和功能的影响,为DCs核酸肿瘤疫苗的制备及其在临床应用奠定基础。方法： 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）将人外周血单核细胞(PBMC)诱导成未成熟树突状细胞（imDCs）,肿瘤细胞坏死因子-α（TNF-α）作用24 h刺激其成熟。实验设为imDCs组和mDCs组。Trizol法提取特异表达癌胚抗原(CEA)的结肠癌细胞SW480总RNA,电穿孔法将总RNA转染mDCs,设为RNA转染DCs组。流式细胞术检测各组细胞表面分子标志变化和转染DCs组的CEA蛋白表达情况。ELISA法检测各组细胞IL-12分泌水平。结果：rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α能将PBMC诱导成具有典型毛刺样突起形态学特征的DCs。imDCs组DCs表面CD1a表达呈阳性,CD80弱阳性,CD83阴性。mDCs组DCs表面CD1a、CD83、CD80表达均呈阳性。RNA转染DCs组DCs表面CD1a、CD83、CD80表达均呈阳性。总RNA转染mDCs后4 h检测到CEA蛋白表达。mDCs组、RNA转染DCs组IL-12分泌量与imDCs组比较均显著升高（P＜0.01), 而mDCs组与RNA转染DCs组比较差异无显著性（P>0.05)。结论：结肠癌细胞总RNA可通过电穿孔法转染mDCs并表达CEA蛋白,电穿孔不改变mDCs的表面分子特征及功能。     

RNAi 技术抑制乳腺癌细胞表皮生长因子受体表达的在体实验研究

目的 探讨采用体外化学合成的小干扰RNA(siRNA)结合阳离子脂质体是否能有效在体转染乳腺癌细胞,以期为RNAi的在体实验研究提供实验数据和理论依据.方法 (1)建立裸鼠肿瘤动物模型,计算成瘤率.(2)体外转染乳腺癌细胞,常规动物接种,测量肿瘤体积和动物重量,计算肿瘤抑制率.(3)采用免疫组化和Western blotting技术测定肿瘤组织的表皮生长因子受体蛋白水平,采用Real-time PCR检测表皮生长因子受体基因水平,采用ELISA检测动物血清及肿瘤抽提蛋白中EGF含量.结果 MDA-MB-231、ZR-75细胞成瘤率依次为30.00%、88.89%,MDA-MB-231细胞的成瘤能力明显弱于ZR-75细胞.ELISA检测结果证实dsRNA-表皮生长因子受体可将血清及肿瘤组织抽提蛋白中的EGF含量分别降低16.77%、12.59%.Real-time PCR结果表明dsRNA-表皮生长因子受体可将表皮生长因子受体基因表达下调21.05%.结论 (1)采用体外化学合成的siRNA结合阳离子脂质体可有效在体转染乳腺癌细胞.(2)在体实验中RNAi效应持续的时间明显长于体外实验.(3)针对表皮生长因子受体基因序列设计的siRNA可作为极具开发前途的抗肿瘤新药,其在体实验中触发RNAi可能的作用机制尚需进一步深入探讨.     

RNA干扰沉默IGF-I R表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的:评价RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体(IGF-I R)表达的阻断效应,和IGF-I R基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变.方珐:应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF-I R特异性小干扰RNA(siRNA),经RT-PCR和Western blot检测IGF-I R表达的改变;联合应用化疗药物顺铂(DDP),通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量(IC50)的变化.结果:IGF-I R表达水平明显下降(抑制率高达89.8%),肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24 h、48 h、72 h的IC50均明显减少,IGF-I R siRNAl组DDP作用72h的IC50为0.92 mg/L,明显低于control-siRNA组的3.77 mg/L,0.5 mg/L DDP联合IGF-I R siRNAl作用48 h后,A549细胞的生长抑制率达32.1%,明显高于control-siRNA组的18.9%,细胞凋亡率从27.8%上升至44.2%.结论:运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-I R的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加.     

转染肿瘤细胞总RNA的树突状细胞联合CIK细胞抗小鼠肝癌作用的实验研究

目的探讨转染小鼠肝癌H22细胞总RNA的树突状细胞(DC)疫苗体外抗小鼠肝癌的免疫作用。方法提取小鼠四肢长骨骨髓,在rmGM-CSF和rmIL-4体外刺激下增殖分化为DC。制备小鼠脾淋巴细胞,在体外经rmIFN-γ、anti-CD3、rmIL-2和rmIL-1b诱导成为细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK细胞)。制备肝癌H22细胞总RNA,体外转染DC,流式细胞仪检测转染前后的DC表面分子的表达情况。将转染H22细胞总RNA的DC和CIK细胞混合培养制备成为效应细胞,LDH释放法测定效应细胞对小鼠H22细胞、S180细胞的杀伤活性。结果经H22细胞总RNA转染后的DC,其MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子及CD83、CD86表达率明显增高,CD14表达率降低(P<0.05)。转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其对S180细胞的杀伤率(P<0.05)。转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其他各组效应细胞对H22细胞的杀伤率(P<0.05)。结论转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞具有高效而特异性的体外抗小鼠肝癌免疫作用。     

靶向树突状细胞的肿瘤疫苗OVA慢病毒载体构建及其体外抗肿瘤效应

目的构建靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)的肿瘤疫苗pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体,并观察肿瘤抗原特异性DC激活T细胞对小鼠Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell,LLC)的抗肿瘤效应,为肺癌的临床治疗提供实验依据。方法以分子克隆方法构建携带模拟肿瘤抗原鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的慢病毒表达载体,经XhoⅠ及XbaⅠ双酶切后电泳和DNA测序验证;应用脂质体法三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,转导LLC,进行单克隆化筛选培养后,经RT-PCR、Western blot检测所获得的OVA稳定表达细胞株中OVA的表达;分离纯化小鼠骨髓DC;用慢病毒感染DC;分离纯化小鼠脾T淋巴细胞;应用MLR和MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激T淋巴细胞对LLC的杀伤作用。结果 (1)构建的pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体经酶切后电泳和DNA测序,结果显示载体构建正确;(2)获得了纯化的小鼠骨髓来源的DC;(3)获得了携带肿瘤抗原OVA的LLC和DC;(4)负载肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞能有效地杀伤负载相同肿瘤抗原的LLC。结论本研究成功地构建了携带肿瘤模拟抗原OVA的慢病毒表达载体pHR-CMV-EGFP-OVA,并成功地转导LLC与DC,获得了稳定表达OVA的肺癌细胞株和携带OVA的DC,基于肿瘤抗原靶向DC的抗肿瘤策略能有效地杀伤LLC,为靶向DC的肺癌免疫治疗提供了体外实验依据。     

利用小干扰RNA表达框鉴定小鼠骨髓树突状细胞有效沉默RelB基因的实验研究

目的 构建靶向小鼠RelB基因的小干扰RNA（siRNA）表达框，鉴定针对小鼠骨髓树突状细胞（DC）的RelB基因最有效的siRNA序列。方法 利用PCR方法构建3个不同位点的表达框，R1／siRNA、R2／siRNA和R3／siRNA分别位于1027、302和1121位点。利用阳离子脂质体AdvantGene转染小鼠骨髓DC，转染24h后，脂多糖（LPS）刺激DC，用RT-PCR和免疫荧光方法检测DCReIB基因表达的变化。结果 经LPS刺激后DC成熟，RelB基因表达显著高于未成熟DC；R1／siRNA和R3／siRNA转染DC后，LPS刺激仍然可以增强RelB基因表达，而R2／siRNA转染DC后，LPS刺激不能增加RelB基因表达。结论 R2／siRNA可有效抑制RelB基因表达，有望用于构建新的耐受性DC应用于临床免疫耐受的诱导。     

经癌胚抗原重组痘苗病毒转染的树突状细胞体外诱导特异性T细胞免疫

目的 研究人癌抗原重组痘苗病毒（rV－CEA）转染上周血树突状细胞（DC）后能否在体外诱导CEA特异性细胞性T淋巴细胞免疫。方法 将rV－CEA转染外周血单核细胞来源的DC后用于激发同源的T细胞，检测其对T细胞的增殖作用以及对CEA分泌性肿瘤细胞的杀伤活性，并与未经rV－CES转染的DC激发的T细胞进行比较。结果 经rV－CEA转染的DC激活的T细胞对CEA分泌性肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。结论 rV－CEA转染的DC可以诱导CEA特异性T细胞活性。     

携带CML28基因的2型重组腺相关病毒的构建及体外转染树突状细胞

 目的 构建携带肿瘤抗原CML28基因的2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV2/CML28）,检测其体外转染人树突状细胞（dendritic cells,DCs）后对DCs的影响和目的基因CML28的表达。方法 将CML28基因克隆到2型重组腺相关病毒载体系统（AAV Helper-Free System）中的真核表达质粒pAAV-IRES-hrGFP,将酶切和DNA测序鉴定后的重组表达质粒pAAV-CML28-hrGFP与AAV Helper-Free System 中的病毒包装辅助质粒pAAV-RC和pHelper以磷酸钙法共转染AAV-293细胞,制备携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28。rAAV2/CML28转染体外培养的DCs,RT-PCR法检测CML28的表达,流式细胞术检测DCs的表面分子和rAAV2/CML28转染DCs的效率。结果 流式细胞术证实构建并包装了rAAV2/CML28,该病毒对DCs的转染效率接近30%,病毒转染DCs检测到CML28的表达以及高水平的HLA-DR、CD80、CD83和CD86表达。结论 成功构建了携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28,该病毒介导目的基因在DCs内表达,DCs的成熟没有因病毒转染受到不良影响,为应用CML28转基因DCs诱导CML28特异性抗肿瘤免疫研究奠定了基础。     

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）沉默MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用siPORT-脂质体（1ipid）中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链siRNA人胰腺癌BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测MAT1基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条MAT1-siRNA序列中有一半可显著抑制BxPC3细胞的生长。体外转染MAT1-siRNA72h后,BxPC3细胞生长抑制率达34．9％（P〈0．01）;83．9％的BxPC3细胞滞留于G。／G,期,而空白对照组仅59．86％（P〈0．01）。体外转染MAT1-siRNA48h后MAT1-mRNA水平下调了80．12％,72h后MAT1蛋白质水平下调了50．12％,与各对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．01）。MAT1-siRNA注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组（均P〈0．05）,抑瘤率达42．53％。结论siRNA介导的MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，导入人胶质瘤细胞U251中，研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则，在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列，间以9个核苷酸的茎环序列，两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中，获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin；采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251；分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果；采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后，U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达，并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

siRNA干扰胰岛新生相关蛋白表达对胰岛细胞株INS-1细胞增殖的抑制作用

目的 探讨靶向胰岛新生相关蛋白(INGAP)基因RNAi对胰岛细胞增殖的抑制效应.方法 设计合成siRNA,通过脂质体转入胰岛细胞株INS-1中,研究其对靶基因的抑制效应,采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪、Western-blot法分别检测转染后的INS-1细胞中INGAP mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖.结果 结果显示siRNA6序列对细胞增殖有明显的抑制效应,INGAP mRNA及蛋白表达明显降低,INS-1细胞增殖受到抑制,P<0.05.结论 干扰INGAP基因的表达能有效抑制胰岛细胞的增殖,INGAP有可能成为治疗β细胞严重减少或损害的重要新靶点.

Abstract：

Objective To investigate the effect of small interfering RNA (siRNA)-mediated islet neogenesis associated protein (INGAP) gene silencing on the proliferation of islet cells. Methods Different siRNAs targeting INGAP gene were designed and transfected into INS-1 islet cells, and the expression levels of INGAP mRNA and protein following the transfection were detected using RT-PCR, flow cytometry and Western blotting. The proliferation of the transfected INS-1 cells was evaluated using MTT assay. Results Compared with those in the irrelevant siRNA, empty vector control, and un-transfected groups, the expression levels of INGAP mRNA and protein in the cells transfected with siRNA6 were reduced significantly. The cell proliferation rate significantly increased after transfection with siRNA6 (P<0.05). Conclusion siRNA targeting INGAP can effectively down-regulate INGAP expression and inhibit the proliferation of INS-1 cells.     

沉默MagT1影响大鼠心肌细胞内Mg2+水平和细胞凋亡的研究

目的 使用siRNA沉默大鼠心肌细胞的镁离子转运蛋白1(MagT1),检测细胞内Mg2+浓度变化和细胞凋亡情况.方法 设计并合成MagT1 siRNA序列,转入原代培养大鼠心肌细胞沉默MagT1,使用反转录PCR和Western blot检测MagT1mRNA和蛋白表达情况,荧光显微镜检测细胞内Mg2+浓度变化情况,流式细胞法检测细胞凋亡情况.结果 相比阴性siRNA组,MagT1 siRNA转染大鼠心肌细胞48 h,MagT1 mRNA的沉默效率为51.83％ (P＜0.05),MagT1蛋白的沉默效率为56.75％(P＜0.05),胞内Mg2+浓度降低29.13％ (P＜0.05),细胞凋亡率为31.18％ (P＜0.01);转染60 h,MagT1 mRNA的沉默效率为86.91％ (P＜0.01),MagT1蛋白质的沉默效率为83.85％ (P＜0.01),细胞内Mg2+浓度降低41.32％ (P＜0.01),细胞凋亡率为40.61％ (P＜0.01).结论 MagT1被显著沉默后,细胞内Mg2+浓度显著降低,细胞凋亡显著提高,细胞生命活动受到较大影响.     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

Induction of T-cell immunity against leukemia by dendritic cells pulsed with total RNA isolated from leukemia cells

Objectives To assess the feasibility and efficacy of eliciting leukemia-specific T-cell responses in syngeneic mice in vitro and in vivo using dendritic cells (DCs) pulsed with total RNA from leukemia cells.Methods DCs generated from bone marrow culture in vitro in the presence of combined cytokines were pulsed with cellular total RNA isolated from cultured L615 cells by cationic lipid 1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonium) propane (DOTAP). T-cell responses were evaluated by in vitro proliferation, and cytotoxicity assay. And in vivo immune protection and proghosis of mice with leukemia were studied.Results DCs pulsed with total RNA isolated from cultured L615 cells (DCs/RNA) were remarkably effective in stimulating L615-specific T-cell response in vitro, but did not cross-react with other leukemia cells from syngeneic mice. Vaccination of naive mice with viable DCs/RNA vaccine was able to partly protect from challenge with a lethal dose of live L615 cells, leading to low leukemia incidence and overall survival prolongation. Statistically significant survival was also observed in a low lethal dose of L615-bearing mice that received treatment using viable DCs∕RNA vaccine alone, suggesting that systemic administration of IL-2 could enhance the anti-tumor efficacy of leukemia RNA/DCs vaccine.Conclusions These data support the use of DCs/RNA vaccine as a feasible and effective route to elicit leukemia immunity against unidentified leukemia-associated antigens for treatment of leukemia-bearing animals.     

两种抗原致敏方式负载树突状细胞疫苗对结直肠癌细胞株的体外杀伤作用

目的 比较两种抗原负载方式对树突状细胞(DCs)疫苗的影响.方法 抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养.通过反复冻融LoVo细胞,提取肿瘤细胞裂解物或者使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DCs,诱导特异性细胞毒性T细胞.检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测两组CTL对LoVo细胞的杀伤作用.结果 两种方式均可培养的成熟DCs,诱导的CTL细胞分泌IFN-γ有所增加;转染后DCs诱导特异性CTL可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LoVo细胞,腺相关病毒提呈抗原制备的DCs疫苗对LoVo细胞的杀伤作用明显高于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式.结论 两种抗原提呈方式均可培养出成熟的DCs,不明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能,并可诱导自体CTL增殖.使用腺相关病毒转染DCs的方式明显优于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式.     

小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰的树突细胞诱发特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究

目的：研究小鼠结肠癌细胞CT-26RNA体外转染mIL-12基因修饰的树突细胞（DC），观察其诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能力。方法：小鼠骨髓细胞体外经rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养获取DC，流式细胞仪检测其纯度；293细胞扩增携带mIL-12基因的重组腺病毒，体外转染DC；Trizol法提取CT-26细胞总RNA，应用TransMessenger体外转染mIL-12基因修饰的DC；ELISA法检测细胞上清及小鼠血液中mIL-12，LDH释放法检测小鼠体内特异性CTL活性。结果：小鼠骨髓细胞经诱导培养后，获得大量高纯度的DC，流式细胞仪检测CD11c^＋的DC〉90％；携带mIL-12基因重组腺病毒转染的DC细胞高表达mIL-12；CT-26细胞总RNA体外转染mIL-12基因修饰的DC后，回输小鼠，能明显提高小鼠体内mIL-12的水平，并可诱导体内生成较高水平的CTL活性，而以该RNA转染Ad-LacZ修饰DC后的对照组及RNA转染DC的对照组，可诱导机体生成中等水平的特异性CTL活性，DC、PBS对照组则均无此作用。结论：小鼠肠癌CT-26细胞总RNA转染mIL-12基因修饰的DC后，免疫接种小鼠，可提高小鼠体内mIL-12的水平，并能有效诱导机体产生较高水平的特异性CTL活性。